效应蛋白OhEF 2 正调控拟南芥对橡胶树白粉菌的感病性

程 度，戎 伟，梅双双

（1.海南大学 生命科学与药学院，海口 570228; 2.海南大学 植物保护学院，海口 570228）

白粉菌（Powdery mildew）是一种专性活体寄生真菌，可以侵染多种植物，造成巨大的经济损失[1−2]。白粉菌与寄主相互作用的过程中，首先刺入寄主细胞壁形成吸器（haustorium），从寄主细胞内获取水分和营养物质。同时，白粉菌通过在吸器转录，翻译形成大量的效应蛋白（Effector proteins），分泌到寄主细胞内，从而实现在寄主体内的增殖和侵染[3−4]。目前，利用基因组、转录组测序及蛋白质组分析，通过对大麦白粉菌（Bgh，Blumeria graminisf.sp.Hordei）、小麦白粉菌（Bgt，Blumeria graminisf.sp.tritici）、拟南芥白粉菌（Gor，Golovinomyces orontii）、葡萄白粉菌（En，Erysiphe necator）和葫芦白粉菌（Pxa，Podosphaera xanthii）等进行预测，发现了一些潜在的效应蛋白[5]。大麦和小麦白粉菌编码的效应蛋白数量最多，通常是一些小的蛋白质，并且与已知蛋白同源性很低[6]。另外，大麦白粉菌形成的效应蛋白N 端通常含有一个保守的结构域：第一个氨基酸是芳香族氨基酸（酪氨酸，苯丙氨酸或色氨酸），最后一个氨基酸是半胱氨酸（Y/F/WXC）[7]。然而，双子叶植物白粉菌编码的效应蛋白并不是都含有该保守结构域[8−9]。白粉菌是专性活体寄生，无法进行遗传操作，因此，目前对白粉菌效应蛋白功能的了解还非常少。最近，通过寄主诱导的基因沉默技术（HIGS，host-induced gene silencing），发现大麦白粉菌的一些效应蛋白在刺入寄主植物和形成吸器的过程中发挥毒性功能[10]。橡胶树白粉病是由橡胶树白粉菌（Oidium heveae)引发的一种真菌病害，对天然橡胶的生产造成了严重的经济损失。该病于1918 年在印尼爪哇首次发现[11−13]，迄今已遍布全球各橡胶种植区。由于橡胶树白粉菌与橡胶树很难进行遗传操作，因此严重阻碍了二者相互作用机理的研究。最近研究发现，橡胶树白粉菌在野生型拟南芥Col-0 激发依赖于EDS1（enhanced disease susceptibility 1)和PAD4（Phytoalexin Deficient 4)的抗病反应，推测拟南芥TIR-NB-LRR（Toll-Interleukin1 Receptor-nucleotide binding-leucine-rich repeat)类抗性基因参与了对橡胶树白粉菌的识别过程[14]。

通过基因组和转录组测序分析，预测出橡胶树白粉菌含有133 个潜在的效应蛋白[8]，然而，这些效应蛋白的功能还是未知的。笔者克隆了橡胶树白粉菌潜在的效应蛋白基因OhEF 2(Oidium heveaeeffector protein 2)，并对该效应蛋白结构进行分析，构建在Col-0 背景下的OhEF 2基因过表达转基因植株。结果表明，过表达植株对橡胶树白粉菌敏感性增加，并且有效降低了橡胶树白粉菌在拟南芥上诱导的胼胝体沉积和致病相关基因的表达。

1 材料与方法

1.1 植物材料和菌株植物材料：拟南芥野生型Col-0，Hevea brasiliensis73397；菌株：O.HeveaeHN1106[14]，假单胞菌DC 3000。

1.2 效应蛋白OhEF 2 拟南芥转基因植株的构建橡胶树叶片古铜期接种白粉菌，8 d 后剪取叶片，利用快速通用植物RNA 提取试剂盒3.0（北京华越洋公司，产品编号：0416-50）提取总RNA。反转录试剂盒（北京华越洋公司，产品编号：HYY871）进行反转录，获得cDNA。设计用于扩增OhEF 2基因的引物OhEF 2-F 和OhEF 2-R，进行PCR 扩增。引物序列：OhEF 2-F，5′-AAACTCGAGCATCCTGGTCAGAAAC GAGA-3′；OhEF 2-R，5′-AAATTCGAAGTTTCCAATAGTTTGAGCAAT-3′（Gene_id:OH_02339）[8]。利用限制性内切酶Xho I和BstB I（NEB 公司）分别对PCR 扩增片段和pER8[15]载体进行酶切。T4（NEB 公司）连接酶进行连接，测序正确后转入农杆菌GV3101。利用花粉管侵染方法，侵染拟南芥野生型Col-0。收取拟南芥种子，在含有潮霉素的MS 培养基中筛选，挑取长根的拟南芥植株，移栽土中。

1.3 植物叶片蛋白提取和蛋白质免疫印迹生长4 周后，喷洒雌激素，剪取1 个叶片，放入1.5 mL 离心管中，加入100 μL 蛋白提取液（0.15 mol·L−1KCl，50 mmol·L−1HEPES-KOH，pH 7.5，1 mmol·L−1EDTA，1 mmol·L−1DTT，0.2% Triton-X 100，cocktail 蛋白酶抑制剂），研碎后，12 000 r·min−1，4 ℃，离心10 min，取上清，加入loading buffer，进行SDA-PAGE 电泳[15]。

利用湿转法在转膜电泳槽（伯乐）中，将蛋白条带转移至PVDF 膜上，转膜液(7.58 g Tris，36 g Glycine，800 mL 甲醇，加水至4 L),电压100 伏，电泳1 h。5%的脱脂奶粉，室温封闭2 h，加入FLAG 抗体（sigma），室温孵育2 h，加入HRP 标记的羊抗鼠2 抗，室温作用0.5 h，在黑暗条件下显影、定影。

1.4 白粉菌细胞进入率计算方法将长40 cm，宽40 cm，孔径为50 μm 的尼龙膜接种箱置于生长5 周的拟南芥植株上方，用毛笔刷将橡胶树白粉菌从橡胶树叶片刷到接种箱上，白粉菌透过接种箱，均匀洒落在拟南芥叶片上。橡胶树白粉菌为橡胶树古铜期叶片接种10 d 后的白粉菌孢子。接种1 d 后，剪取叶片，置于脱色液：体积比(乙醇︰苯酚︰水︰乳酸= 2︰1︰1︰1)中，脱色过夜。次日，于考马斯亮蓝染色液（G250，浓度为6 g·L−1乙醇溶液)中染色30 s。脱色后，显微镜下进行观察。计数橡胶树白粉菌产生1 根芽管和2 根芽管的白粉菌孢子数目。利用计算公式：2 根芽管孢子数目/(1 根芽管孢子数目+2 根芽管孢子数目)，计算细胞进入率[14]。

1.5 菌丝生长长度分析利用接种箱在拟南芥叶片接种橡胶树白粉菌，接种2 d 后，剪取叶片，于脱色液中脱色过夜。考马斯亮蓝染色30 s，显微镜观察，利用MIE3.1 软件测量菌丝长度[14]。

1.6 叶片发病表型观察及分生孢子计数利用接种箱在拟南芥叶片接种橡胶树白粉菌，接种10 d 后，观察叶片发病症状并进行拍照。剪取叶片置于脱色液中脱色过夜，考马斯亮蓝染色液中染色30 s，计数单个孢子产生的分生孢子数[14]。

1.7 拟南芥总RNA 提取和致病相关基因PR1 (Pathogenesis-Related Gene1)表达检测利用接种箱在拟南芥叶片接种橡胶树白粉菌，接种6 d 后。剪取叶片，置于遇冷的研钵中，加入液氮，研磨3 次。最后加入1 mL Invitrogen Trizol (Lot No.66223)，提取总RNA。经DNA 酶消化后，加水溶解。利用Invitrogen RNA 反转录试剂盒Ⅲ (Lot No.696045)对总RNA 进行反转录。荧光定量PCR 检测采用SYBR Premix ExTaq Ⅱ(Lot No.AK2702)试剂，7500 ABI Real-time PCR Detection System，20 μL 反应体系。检测程序为：预变性95 ℃ 30 s；变性95 ℃ 5 s、退火延伸62 ℃ 40 s，40 个循环。内参基因ACTIN 引物序列为：5′-TGGTGGAAGCACAGAAGTTG-3′；5′-GATCCATGTTTGGCTCCTTC-3′；PR1：5′-TACGCAGAACAAC TAAGAGG-3′；5′-TCGTTCACATAATTCCCACG-3′[14]。

1.8 胼胝体计数分析利用接种箱在拟南芥叶片接种橡胶树白粉菌，接种6 d 后。将叶片置于脱色液，V水︰V甘油︰V乳酸︰V水饱和酚︰V乙醇=1︰1︰1︰1︰8，抽真空30 min，65 ℃放置60 min，10 min 摇1 次。50%酒精和水漂洗各漂洗1 次。将叶片置于染色液(0.1 g·L−1苯胺蓝，150 mmol·L−1K2HPO4，pH9.5)中染色60 min。于荧光显微镜紫外激发光下照相。采用Image J 软件(http://www.uhnresearch.ca/wcif)对0.1 mm2叶片面积内的胼胝体进行计数，每个样品共计数6 片叶片，通过Student’s t test 进行统计分析,差异极显著P<0.01,差异显著P<0.05[14]。

2 结果与分析

2.1 橡胶树白粉菌效应蛋白OhEF 2 拟南芥转基因植株的构建白粉菌通过分泌效应蛋白到植物体内，从而完成白粉菌的侵染过程。笔者克隆了其中的1 个效应蛋白基因OhEF 2（Gene_id:OH_02339）[8]，该蛋白编码543 个氨基酸，信号肽分析发现1～21 个氨基酸为其信号肽序列（图1）。为了研究该效应蛋白在植物体内的作用机理，设计引物，去除信号肽序列，经过PCR 扩增、酶切后连入雌激素诱导的转基因载体pER8。利用潮霉素筛选，通过雌激素诱导和蛋白质印迹分析后，获得了3 个在拟南芥Col-0 背景下独立的OhEF 2转基因植株，分别命名为OhEF 2-1，OhEF 2-2 和OhEF 2-3（图2A，B）。雌激素诱导6 d 后，与野生型植物Col-0 和空载体转基因植株对比，并未发现效应蛋白OhEF 2 可以激发拟南芥细胞坏死和发黄的表型（图2B）。

图1 效应蛋白OhEF 2 信号肽序列分析Fig.1 Signal peptide analysis of effector protein OhEF 2

图2 橡胶树白粉菌效应蛋白OhEF 2 拟南芥转基因植株的构建A.效应蛋白OhEF 2 转基因植株表型观察；B.效应蛋白OhEF 2 转基因植株蛋白表达分析。Bar=1 cm。Fig.2 The construction of Oidium heveae effector OhEF 2 transgenic plants in Arabidopsis Col-0 backgroundA.The phenotype observation of effector OhEF-2 transgenic plants; B.Protein detection of effector OhEF-2 transgenic plants.Bar=1 cm.

图3 效应蛋白OhEF 2 正调控拟南芥对橡胶树白粉菌的感病性A.橡胶树白粉菌细胞进入率测定结果；B.橡胶树白粉菌菌丝生长测定结果；C.分生孢子计数结果。**：P<0.01。Fig.3 Effector protein OhEF 2 positively regulates the susceptibility of Arabidopsis to Oidium heveaeA.Quantitative assessment of host cell entry rates; B.Quantitative analysis of hyphal growth of O.heveae; C.The numbers of conidiospores per colony were counted at 10 dpi.**: P<0.01.

2.2 效应蛋白OhEF 2 正调控拟南芥对橡胶树白粉菌的感病性为了进一步研究效应蛋白OhEF 2 在植物体内的作用机理，在野生型Col-0，空载体转基因植株和OhEF 2转基因植株OhEF 2-1，OhEF 2-2 和OhEF 2-3 上分别接种橡胶树白粉菌O.HeveaeHN1106。接种1 d 后，白粉菌细胞进入率统计分析结果表明，3 个转基因植株显著高于野生型Col-0 和空载体转基因植株(图3A)，Col-0 和空载体转基因植株白粉菌细胞进入率约为35%,无明显差异，3 个OhEF 2转基因植株白粉菌细胞进入率约为75%，与野生型植物相比，差异极显著(P<0.01)。接种2 d 后的菌丝生长长度计算结果表明，3 个OhEF 2转基因植株同样显著高于野生型Col-0 和空载体转基因植株(图3B)，Col-0 和空载体转基因植株菌丝长度约为30 μm，无明显差异，3 个OhEF 2转基因植株菌丝长度约为90 μm，与野生型植物相比，差异极显著(P<0.01)。接种10 d 后，3 个OhEF 2转基因植株出现典型的白粉病病斑（图4A），野生型Col-0 和空载体转基因植株并未出现白粉病病斑（图4A），而是表现出叶片发黄的症状（图4A）。分生孢子计数分析结果表明，橡胶树白粉菌不能在野生型Col-0 和空载体转基因植株上产生分生孢子，而在3 个OhEF 2转基因植株上形成了大量的分生孢子（图3C，4B）。综上所述，效应蛋白OhEF 2 可以明显增强拟南芥对橡胶树白粉菌感病的表型。

2.3 效应蛋白OhEF 2 不能促进假单胞菌DC 3000 在拟南芥上的毒性效应蛋白OhEF 2 可以明显提高橡胶树白粉菌在拟南芥上的毒性，为了验证OhEF 2 是否也可以促进其他病原菌的毒性，笔者在野生型拟南芥Col-0、空载体转基因植株和OhEF 2转基因植株OhEF 2-1，OhEF 2-2，OhEF 2-3 上接种了假单胞菌DC 3000。假单胞菌作为活体寄生病原微生物，其与寄主植物的互作机制已有比较深入的了解。分别在接种后0 d 和3 d 取样、研磨、涂板，进行细菌计数。结果表明，假单胞菌DC 3000 在野生型植物和空载体转基因植株以及OhEF 2转基因植株上并未表现出明显的生长差异（图5），结果表明，效应蛋白OhEF 2 不能促进假单胞菌DC 3000 的毒性。

图4 OhEF 2 转基因植株叶片发病症状及显微观察结果A.叶片症状观察结果，Bar=5 mm；B.显微观察结果，Bar=200 μm。Fig.4 Symptoms and light microscopy of leaves of OhEF2 transgenic plants inoculated with Oidium heveaeA.Symptoms of WT Col-0/ Empty vector and OhEF 2 transgenic plants at 10 dpi, Bar=5 mm; B.Light microscopy images,Bar=200 μm.

2.4 蛋白OhEF 2 抑制橡胶树白粉菌在拟南芥上激发的胼胝体沉积和PR1 基因表达效应蛋白OhEF 2 显著增强了拟南芥对橡胶树白粉菌的感病性，推测OhEF 2 可能抑制了橡胶树白粉菌在拟南芥上激活的抗病反应。为了确定这一可能性，笔者在野生型Col-0、空载体转基因植株和OhEF 2转基因植株OhEF 2-1、OhEF 2-2、OhEF 2-3 上分别接种橡胶树白粉菌O.HeveaeHN1106。接种6 d 后，剪取接种叶片，进行了胼胝体沉积分析和PR1基因表达分析。结果表明，与野生型相比，橡胶树白粉菌在3 个转基因植株上诱导的胼胝体沉积(图6A，B)和PR1基因表达(图7)都显著降低，表明效应蛋白OhEF 2 有效地抑制了橡胶树白粉菌在拟南芥上激发的抗病反应。

图5 假单胞菌DC 3000 细菌生长结果Fig.5 Bacterial growth of Pseudomonas syringae DC 3000

图6 效应蛋白OhEF 2 抑制橡胶树白粉菌在拟南芥上激发的胼胝体沉积A.胼胝体计数结果；B.叶片显微观察结果。**：P<0.01。Fig.6 Effector protein OhEF 2 inhibits the callose deposition triggered by Oidium heveae in ArabidopsisA.Average number of callose deposits per microscope field of 0.1 mm2 on Col-0 and OhEF 2 transgenic plants; B.Light microscopy images.Bar=200 μm.**: P<0.01.

3 讨 论

与拟南芥的相互作用过程中，橡胶树白粉菌对拟南芥野生型Col-0 激发抗病反应，并且这种抗病反应依赖于EDS1 和PAD4，但并不依赖于NDR1，推测拟南芥TIR-NB-LRR 类抗性蛋白可以识别橡胶树白粉菌的效应蛋白，从而激活了下游的抗病信号通路[14]。笔者在前人研究的基础上，克隆了橡胶树白粉菌的1 个潜在效应蛋白基因OhEF 2，并构建了该基因在野生型Col-0 背景下雌激素诱导的过表达转基因植株。通过雌激素诱导后，与野生型Col-0 和空载体转基因植株相比，OhEF 2过表达转基因植物并未出现明显的植物叶片发黄表型，暗示着效应蛋白OhEF 2 在植物体内并不是发挥无毒蛋白的功能。

白粉菌作为专性活体寄生真菌，通过分泌大量的效应蛋白到寄主细胞内，发挥毒性功能，帮助白粉菌在寄主体内的侵染和繁殖[16−17]。大麦白粉菌效应蛋白CSEP0064 可以与植物细胞内PR10 蛋白发生相互作用，干扰宿主细胞内核糖体RNA 的降解，抑制植物的免疫反应[18]。通过寄主诱导的基因沉默技术，发现白粉菌Podosphaera xanthii效应蛋白PEC 可以抑制植物细胞内活性氧的产生[10]，从而促进白粉菌的繁殖。笔者通过在野生型Col-0过表达效应蛋白OhEF 2，发现效应蛋白OhEF 2 显著增强了橡胶树白粉菌的毒性功能，并有效降低了橡胶树白粉菌在拟南芥上激发的胼胝体沉积和PR1基因表达。胼胝体沉积在白粉菌的侵染过程中发挥非常重要的作用，在白粉菌侵染早期形成的刺入钉位置，植物细胞产生大量的胼胝体，从而抑制白粉菌的侵染。胼胝体合成酶基因PMR4突变后，植物对白粉菌的感病性大大增强[19]，表明效应蛋白OhEF 2 可能参与了白粉菌侵染的早期阶段，与胼胝体形成的相关基因发生相互作用，从而抑制了胼胝体沉积。另外，PR1基因作为效应蛋白激发免疫信号通路ETI（Effector triggered immunity）的标志基因[20]，暗示着效应蛋白OhEF 2 抑制了植物抗性蛋白识别橡胶树白粉菌后激发的免疫反应。然而，OhEF 2 并不能促进活体寄生假单胞菌DC 3 000 在拟南芥上的毒性，表明橡胶树白粉菌与假单胞菌在植物体内的毒性作用机理可能是不相同的。OhEF 2 能否促进其他白粉菌的毒性功能，尚需进一步验证。

图7 效应蛋白OhEF 2 抑制橡胶树白粉菌在拟南芥上激发的PR1 基因表达**：P<0.01。Fig.7 Effector protein OhEF 2 inhibits the PR1 gene expression triggered by Oidium heveae in Arabidopsis**: P<0.01.