血浆CA19-9、lncRNA HOTTIP 水平对胰腺癌的诊断价值

吕梦，王健

郑州大学第二附属医院，郑州450003

胰腺癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一。近年来，随着我国居民生活方式转变和生活质量提高，胰腺癌的发病率明显上升。胰腺癌起病隐匿，早期诊断困难，能够早期诊断并接受根治性手术者仅占5%～15%，多数患者确诊时已属中晚期，治疗效果不理想，预后极差［1］。因此，早期筛查、诊断进而早期治疗对延长胰腺癌患者生存时间具有重要意义。有研究表明，糖类抗原（CA）和长链非编码RNA（lncRNA）在胰腺癌的发生、发展过程中具有重要作用［2］。CA19-9是一种存在于血液循环的胃肠道肿瘤相关抗原，并且不受妊娠、吸烟、年龄等因素影响，是迄今发现的对胰腺癌敏感度最高的肿瘤标志物［3］。但鉴于肿瘤标志物单项检测具有一定局限性，在临床上往往联合检测多种肿瘤标志物，以提高诊断准确率。HOXA 末端转录本反义RNA（HOTTIP）属于lncRNA家族成员之一，其作为分子向导可特异性连接并募集混合系白血病复合体/WD 重复蛋白5，激活并转录HOXA 基因，从而影响肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移等生物学过程。有研究报道，lncRNA HOTTIP 与多种消化系统恶性肿瘤的发生、发展密切相关［4］。但目前鲜有血浆CA19-9、lncRNA HOTTIP 水平联合诊断胰腺癌的报道。为此，本研究探讨了血浆CA19-9、lncRNA HOTTIP 水平对胰腺癌的诊断价值。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2019 年1 月—2020 年1 月郑州大学第二附属医院收治的胰腺癌患者79 例（胰腺癌组）。所有患者符合《胰腺癌综合诊治中国专家共识（2014 年版）》［5］中的诊断标准，并经术后组织病理学检查证实。纳入标准：①符合胰腺癌诊断标准；②TNM 分期［6］Ⅰ～Ⅲ期；③年龄≥18 岁；④临床资料完整。排除标准：①合并其他良恶性肿瘤者；②合并自身免疫性疾病者；③合并心血管疾病者；④合并急慢性感染者；⑤合并血液系统疾病者。其中，男54例、女25例，年龄46～82（61.58±4.65）岁，BMI 19～29（25.32 ± 2.15）kg/m2，有吸烟史30 例，有饮酒史15 例。同期选择郑州大学第二附属医院收治的胰腺炎患者63 例（胰腺炎组），男43 例、女20例，年 龄43～85（61.28 ± 3.74）岁，BMI 18～28（24.97 ± 2.23）kg/m2，有吸烟史6 例，有饮酒史17例。同期另选在郑州大学第二附属医院体检健康的志愿者50例（对照组），男34例、女16例，年龄40～80（60.27±4.36）岁，BMI 18～28（24.87±2.18）kg/m2，有吸烟史3 例，有饮酒史9 例。三组性别、年龄、BMI、吸烟史、饮酒史等临床资料具有可比性。本研究经郑州大学第二附属医院医学伦理委员会批准（审批文号：2018-10-08F），所有研究对象知情同意并签属知情同意书。

1.2 血浆CA19-9 检测 所有研究对象入组后，采集清晨空腹肘静脉血5 mL，3 000 r/min离心10 min、离心半径8 cm，留取上层血浆，置于-80 ℃冰箱保存。采用ELISA 法检测血浆CA19-9。所有操作严格按ELISA试剂盒说明进行。

1.3 血浆lncRNA HOTTIP 检测 所有研究对象入组后，采集清晨空腹肘静脉血5 mL，EDTA-K2抗凝，3 000 r/min 离心10 min、离心半径10 cm，留取上层血浆，置于-80 ℃冰箱保存。待标本成批后，按总RNA 提取试剂盒说明提取总RNA，经紫外分光光度计鉴定，提取的总RNA 纯度和浓度合格，可用于后续实验。按去除基因组DNA 试剂盒说明将总RNA逆转录为cDNA。以cDNA 为模板，按实时荧光定量PCR 试剂盒说明进行PCR 扩增。引物序列：lncRNA HOTTIP 上游引物5"-AGTGTGTCATAGAGCTTCCT⁃GTTTCATCTCCCAGT-3"，下游引物5"-TGGAAC⁃CAGGCCCCAGGGAATCTTTCAGCTGCATT-3"；GAP⁃DH 上游引物5"-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3"，下游引物5"-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3"。按实时荧光定量PCR 试剂盒说明配制反应体系。反应条件：95 ℃5 min，95 ℃30 s、60 ℃30 s、72 ℃30 s共45个循环。由ABI 7500 系统软件SDS 自动获取阈值循环数（CT）。以GAPDH 为内参，采用2-ΔΔCT法计算lncRNA HOTTIP相对表达量。

1.4 资料收集与分析 收集胰腺癌患者性别、年龄、BMI、吸烟史、饮酒史、肿瘤直径、淋巴结转移、TNM 分期等临床资料，分析血浆CA19-9、lncRNA HOTTIP水平与患者临床病理特征的关系。1.5 统计学方法 采用SPSS26.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，多样本均数比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；两样本均数比较采用独立样本t检验。计数资料比较采用χ2检验。相关性分析采用Pearson 相关分析法。采用受试者工作特征（ROC）曲线评估血浆CA19-9、lncRNA HOTTIP 水平对胰腺癌的诊断价值。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组血浆CA19-9、lncRNA HOTTIP 水平比较见表1。

表1 三组血浆CA19-9、lncRNA HOTTIP水平比较（ ±s）

表1 三组血浆CA19-9、lncRNA HOTTIP水平比较（ ±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与胰腺炎组比较，#P＜0.05。

组别n对照组胰腺炎组胰腺癌组lncRNA HOTTIP相对表达量0.54±0.05 0.57±0.17 1.31±0.29*#50 63 79 CA19-9（U/mL）23.36± 7.83 26.78± 8.47 490.26±147.78*#

2.2 血浆CA19-9、lncRNA HOTTIP 水平与胰腺癌患者临床病理特征的关系 见表2。

表2 血浆CA19-9、lncRNA HOTTIP水平与胰腺癌患者临床病理特征的关系

2.3 胰腺癌患者血浆CA19-9 水平与血浆lncRNA HOTTIP 水平的关系 Pearson 相关分析显示，胰腺癌患者血浆CA19-9 水平与血浆lncRNA HOTTIP 水平呈正相关关系（r=0.570，P＜0.05）。

2.4 血浆CA19-9、lncRNA HOTTIP 水平诊断胰腺癌的效能分析 绘制血浆CA19-9、lncRNA HOTTIP水平单独或联合诊断胰腺癌的ROC 曲线，结果发现，血浆CA19-9 水平诊断胰腺癌的曲线下面积（AUC）为0.799（95%CI：0.707～0.872），其最佳截断值为112.59 U/mL，此时其诊断胰腺癌的敏感度为77.28%、特异度为64.67%；血浆lncRNA HOTTIP水平诊断胰腺癌的AUC为0.859（95%CI：0.775～0.920），其最佳截断值为0.75，此时其诊断胰腺癌的敏感度为68.08%、特异度为82.15%；血浆CA19-9、lncRNA HOTTIP 水平联合诊断胰腺癌的AUC为0.920（95%CI：0.848～0.965），其诊断胰腺癌的敏感度为88.54%、特异度为91.06%。血浆CA19-9、lncRNA HOTTIP 水平联合时诊断胰腺癌的AUC高于血浆CA19-9、lncRNA HOTTIP水平单独时（Z分别为3.010、2.174，P均＜0.05）。见图1。

图1 血浆CA19-9、lncRNA HOTTIP水平诊断胰腺癌的ROC曲线

3 讨论

据全球疾病负担研究报道，2017 年我国胰腺癌的发病率和病死率分别为5.92/10 万、6.02/10 万，较1990 年分别增长了180.45%、184.80%［7］，已成为威胁我国居民健康的一大杀手。有研究认为，早期诊断和根治性手术治疗是影响胰腺癌患者预后的重要因素［8］。组织病理学检查是目前诊断胰腺癌的金标准。但胰腺位于腹膜后，位置较深并且毗邻血管，周围结构复杂，难以获取病变组织。超声、MRI、CT等影像学检查是诊断胰腺癌的常用方法，但由于胰腺位置和周围结构的原因，缺乏足够的敏感度和特异度，特别是直径＜2 cm 的病变组织，诊断准确率较低。肿瘤标志物是肿瘤细胞产生并释放入血液的多肽、激素、蛋白抗原等物质，正常人体内含量极低。近年来，随着生物医学技术的发展，许多肿瘤标志物研究取得了较大进展，有效地弥补了影像学诊断滞后的缺点。

CA19-9 是一种存在于血液循环的胃肠道肿瘤相关抗原，与Lewis 血型成分有关，非肿瘤细胞特有，也存在于结肠、胃、胰腺等正常组织细胞中。生理状态下，人体内CA19-9 含量极低，仅在某些恶性肿瘤发生时明显升高，是迄今发现的对胰腺癌诊断敏感度最高的肿瘤标志物［9］。本研究结果发现，胰腺癌组血浆CA19-9 水平明显高于胰腺炎组和对照组，而胰腺炎组与对照组比较差异无统计学意义，提示胰腺癌患者血浆CA19-9水平明显升高，并且不受急慢性胰腺炎症的影响。本研究结果显示，血浆CA19-9 水平与胰腺癌肿瘤直径、TNM 分期有关，随着胰腺癌肿瘤体积增大和TNM 分期升高，血浆CA19-9 水平逐渐升高，提示血浆CA19-9 水平能够反映胰腺癌病情程度。随着胰腺癌病情加重，细胞变性坏死增多，组织破坏严重，导致大量的CA19-9释放进入血液循环。同时，胰腺癌细胞破坏可引起胰管梗阻，导致胰岛纤维化，降低或延迟胰岛素分泌进而引起糖代谢紊乱，在高糖状态下，葡萄糖与Lewis血型物质寡糖基序发生非酶促反应，连接Lewis血型物质还原端和非还原端，从而引起血液CA19-9水平升高［10］。DOLSCHEID-POMMERICH 等［11］研究报道，在健康志愿者、非肿瘤性疾病及恶性肿瘤患者血清中均检测到CA19-9，但相比恶性肿瘤患者，健康志愿者和非肿瘤性疾病患者血清CA19-9 水平处于低水平或一过性升高，提示血清CA19-9水平升高与恶性肿瘤的发生有关。但也有研究报道，胰腺癌患者肿瘤直径和TNM 分期与血清CA19-9 水平无关［12］，可能与入选病例的Lewis 血型抗原为阴性有关。这从侧面反映不能单纯以血浆CA19-9 水平来判断肿瘤大小和临床分期。因此，在临床上需要联合其他肿瘤标志物以提高诊断效能，弥补单项检测的不足。

lncRNA 为一类转录本长度超过200 nt 的非编码RNA 分子。随着基因测序、基因芯片等技术的不断发展，目前已发现约3 万种lncRNA。研究表明，lncRNA 能够在转录及转录后水平调节蛋白编码基因的表达，可作为癌基因或抑癌基因的调控因子，参与调节肿瘤的生物学行为［13］。lncRNA HOTTIP是一种定位于HOXA 基因5′末端的lncRNA。有研究认为，lncRNA HOTTIP具备原癌基因特征，可促进多种肿瘤细胞的增殖［14］。LI 等［15］研究发现，胰腺癌细胞lncRNA HOTTIP 高表达，其高表达能够促进胰腺癌的发生、发展；通过siRNA干扰下调胰腺导管癌细胞lncRNA HOTTIP表达后，胰腺导管癌细胞的增殖、侵袭等能力明显降低，对化疗药物的敏感度明显升高。本研究结果发现，胰腺癌组血浆lncRNA HOT⁃TIP 水平明显高于胰腺炎组和对照组，而胰腺炎组与对照组比较差异无统计学意义，提示胰腺癌患者血浆lncRNA HOTTIP 水平明显升高，并且不受急慢性胰腺炎症的影响。lncRNA HOTTIP可竞争性结合miR-137，从而抑制miR-137 的抑癌作用，激活磷脂酰肌醇3-激酶信号通路，磷脂酰肌醇3-激酶信号通路被激活则会磷酸化信号通路中的雷帕霉素靶蛋白和蛋白激酶B，促进肿瘤细胞增殖，并诱导正常细胞恶性转化和凋亡抵抗，导致恶性肿瘤的发生、发展［16］。本研究结果发现，血浆lncRNA HOTTIP 水平与胰腺癌肿瘤直径和TNM 分期有关，这可能与lncRNA HOTTIP 的凋亡抑制作用有关。有研究发现，lncRNA HOTTIP 能够通过抑制促凋亡基因Bcl-2相关X 蛋白表达，进而激活β 连环蛋白细胞信号通路，抑制肿瘤细胞程序性死亡过程，引起肿瘤细胞过度增殖和凋亡抑制，最终导致肿瘤恶性进展［17］。

本研究结果还发现，胰腺癌患者血浆CA19-9水平与血浆lncRNA HOTTIP 水平呈正相关关系，这可能与lncRNA HOTTIP 能够调控CA19-9 水平有关。研究表明，lncRNA HOTTIP能够通过负性调控miRNA表达，导致CA19-9 水平升高［18］。本研究ROC 曲线分析显示，血浆CA19-9、lncRNA HOTTIP 水平单独检测时对胰腺癌的诊断均具有一定价值，但二者联合时诊断胰腺癌的AUC 明显高于二者单独时，提示血浆CA19-9、lncRNA HOTTIP 水平联合检测能够提高胰腺癌的诊断效能。

综上所述，胰腺癌患者血浆CA19-9、lncRNA HOTTIP 水平升高，二者水平升高与胰腺癌病情进展密切相关；血浆CA19-9、lncRNA HOTTIP 水平对胰腺癌的诊断均具有一定价值，二者联合时诊断价值更高。但由于本研究样本量有限且存在选择偏倚，其结论还需多中心、大样本量研究进一步证实。