基于网络药理学探讨六君安胃方减少结肠癌化疗期间消化道不良反应的作用机制研究

闫蕴孜，孙凌云，许云，何斌，张彤，闫韶花，赵娜，杨宇飞

1.北京中医药大学研究生院(西苑临床医学院），北京 100029；2.中国中医科学院西苑医院，北京 100091

高危Ⅱ期及Ⅲ期结肠癌根治术后进行辅助化疗可降低复发转移率，延长无瘤生存期。然而，化疗导致不良反应如化疗相关性恶心呕吐(chemotherapy-induced nausea and vomiting，CINV）、化疗相关性腹泻(chemotherapy-induced diarrhea，CID）降低了患者对化疗的耐受性和依从性，导致很多患者无法按期、按量完成化疗。2017 年依托“国家重点研发计划-中医药现代化研究”，本研究课题组对中国中医科学院西苑医院肿瘤科杨宇飞主任临床应用多年的经验方——“健脾补肾序贯方”对化疗不良反应的干预疗效展开了全国多中心、随机对照临床试验研究。其中六君安胃方是“健脾补肾序贯方”中的第一要方，也属于“两阶段三部曲法”中辅助结直肠癌化疗的第一阶段[1]。

六君安胃方是在传统中药方剂“六君子汤”基础上化裁而成，将原方中的人参改为党参，其余药物为白术、茯苓、甘草、半夏、陈皮。党参具有健脾益肺、养血生津的功效；苓、术相配健脾祛湿；甘草益气和中、调和诸药；半夏降逆止呕，陈皮健脾理气。六君安胃方的主要作用是健脾和胃，顾护中焦后天之本，降低消化道反应，如恶心、呕吐、腹泻、便秘等[1]。由于中药复方成份复杂，六君安胃方在防治CINV 和CID 的作用机制仍不明确。本研究采用网络药理学方法，对六君安胃方多成分、多靶点与疾病之间复杂的网状关系进行探讨研究，为临床治疗及下一步基础实验研究提供参考依据。

1 信息收集与方法

1.1 六君安胃方的中药信息收集按照六君安胃方中中药组成，通过检索中药系统药理学数据库和分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacologydatabaseandanalysisplatform，TCMSP），筛选出党参、白术、茯苓、陈皮、半夏中OB ≥30%且DL ≥0.18 的有效化学成分，由于甘草化学成分较多，故参考相关文献[2]将甘草筛选条件设定为OB ≥50%且DL ≥0.18。

1.2 六君安胃方的化学成分-作用靶点的构建通过TCMSP 平台搜集六君安胃方化学成分的潜在作用靶点，并利用Uniprot(http：//www.uniprot.org/）数据库将基因标准化。利用Cytoscape3.6.0 构建六君安胃方化学成分-潜在作用靶点网络。

1.3 疾病靶点的筛选通过GeneCards(http：//www.genecards.org/）、OMIM(http：//www.omim.org/）、DisGeNET(http：//www.disgenet.org/）等数据库进行检索，以“chemotherapy-inducednauseaand vomiting(CINV）”、“chemotherapy-induced diarrhea(CID）”为检索词，获得与化疗期间消化道反应的相关靶点。

1.4 化疗期间消化道反应PPI 网络的构建利用String 平台(https：//string-db.org/Version 11.0）构建六君安胃方活性成分和化疗期消化道反应相关的蛋白互作网络(protein-protein interaction，PPI），检索条件为“Homo sapiens”，并将“minimum required interaction score”设置为0.9以保证蛋白互作网络的可读性。利用R version 3.6.2对PPI网络图中的前15个关键蛋白绘制条状图。

1.5 基因本体(gene ontology，GO）功能和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析为了进一步说明六君安胃方治疗化疗期间消化道反应的作用情况，通过R ClusterProfiler 对药物-疾病相关作用靶点进行GO和KEGG富集分析。

1.6 分子对接利用AutoDock vina 软件对PPI 网络中degree值排名前5的靶蛋白与六君安胃方中排名第一的有效化学成分进行分子对接验证。从Pubchem 数据库和RCSB PDB 蛋白质结构数据库分别获取六君安胃方中的有效化学成分结构和靶蛋白的三维结构，利用AutoDock Tools对上述蛋白受体和配体进行常规处理，再用Autogrid得到对接的活性位点，然后进行分子对接，结合能≤-5.0 kJ·mol-1为分子与靶点结合性较好。

2 结果

2.1 六君安胃方化学成分及靶点收集

通过TCMSP 数据库检索六君安胃方中中药的有效化学成分和潜在作用靶点，收集到六君安胃方所含的中药有效化学成分共103个，其中来自白术的有7 个、半夏13 个、陈皮5 个、党参21 个、茯苓15 个、甘草42 个；共收集到4 351 个潜在作用靶点，其中白术774 个、半夏1 302 个、陈皮479个、党参896个、茯苓121个、甘草778个，将收集到的靶点通过Uniprot 数据库进行基因标准化并去重后共得到406 个潜在作用靶点；通过GeneCards、OMIM 数据库检索疾病相关关键词共收集到与“CIVN”、“CID”相关的靶点去重后共851个。为了进一步说明六君安胃方对化疗期间消化道不良反应的作用，将406个六君安胃方化学成分相关作用靶点与851个疾病靶点取交集并建立韦恩图，共获得105 个相关靶点(图1）。另将六君安胃方有效成分-疾病相关靶点可视化，利用Cytoscape 中的NetworkAnalyzer 进行网络拓扑分析，可视化图中共获得321个节点，通过Degree排名找到前十的化学成分(表1）。

2.2 六君安胃方相关疾病靶点筛选及PPI 网络构建分析

通过String 平台构建蛋白-蛋白相互作用网络，将“minimum required interaction score”设置为0.9，PPI 网络包含105 个节点，396 条边，平均节点值7.54；利用Cytoscape 将PPI 网络图可视化，每个圆形代表一个蛋白，圆形越大表示蛋白相关节点数目越多(图2），根据蛋白质节点Degree绘制出绘制前15个蛋白质节点条形图(图3）；Degree排名前五的是AKT1、MAPK3、MAPK1、MAPK8、JUN。

表1 六君安胃方化学成分degree排名前十列表Table 1 The top ten list of the degree of Liujunanwei decoction Chemical composition

2.3 GO功能富集分析

利用R 软件ClusterProfiler 对获得的药物活性成分-疾病相关靶点进行过程富集分析，涉及生物过程(Biological Process）、细胞组成(Cellular Component）和分子功能(Molecular Function）三个部分。根据P＜0.05 将排名前20 的条目绘制成条形图。在生物过程中，氧化应激反应、凋亡信号通路调节、脂多糖的反应、细菌起源分子反应、活性氧的反应等生物过程排名靠前(图4）；细胞组成中，膜筏、膜微区域、膜区域、囊泡腔等排名靠前(图5）；分子功能过程中，泛素样蛋白连接酶结合、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激活酶活性、泛素蛋白连接酶结合、内肽酶活性、细胞因子受体结合等分子功能排名靠前(图6）。

2.4 KEGG富集分析

利用R 软件ClusterProfiler 对六君安胃方中筛选出的105 个核心靶点蛋白进行KEGG 富集分析。根据P＜0.05 绘制出排名前20 个信号通路气泡图(图7）。结果显示六君安胃方可能作用的信号通路包括PI3K-AKt 信号通路、细胞凋亡、MAPK 信号通路、内分泌抵抗、铂耐药、TNF信号通路等信号通路。

图1 六君安胃方有效成分作用靶点与疾病靶点关系的韦恩图Figure 1 Venn diagram of relationship between target of the effective ingredients of Liujunanwei decoction and the target of the disease

图2 六君安胃方PPI网络图Figure 2 PPI network diagram of Liujunanwei decoction

图3 六君安胃方Degree条形图Figure 3 Liujunanwei decoction degree bar chart

图4 GO富集分析-生物过程Figure 4 Gene Ontology-Biological Process

图5 GO富集分析-细胞组成Figure 5 Gene Ontology-Cellular Component

图6 GO富集分析-分子功能Figure 6 Gene Ontology-Molecular Function

2.5 分子对接

将六君安胃方的有效化学成分与PPI 网络中排名前5 的蛋白分别对接(表2）。若结合能＜-5.0 kJ·mol-1则认为其结合性好[3]。结果表明，六君安胃方中君药党参中的木犀草素与AKT1结合性最好(图8），其次是JUN、MAPK3、MAPK8、MAPK1。

图7 KEGG富集通路图Figure 7 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes signal pathway

表2 六君安胃方中有效化学成分分子对接Table 2 Molecular docking of effective chemical components in Liujunanwei decoction

图8 木犀草素与AKT1分子对接Figure 8 Molecular docking of luteolin and AKT1

3 讨论

CINV 和CID 均属于现代医学概念，传统中医并无明确记载，但可根据临床症状归属为痞满、呕吐、泄泻等范畴。患者由于素体脾胃虚弱，加之化疗药物刺激脾胃，导致正气虚损，脾失健运，胃失和降，进一步导致干呕、呕吐或者泄泻。既往研究发现六君子汤对5-HT3 受体有拮抗作用，方中提取成分川陈皮素以剂量依赖性方式抑制5-HT 诱导的胃排空延迟[4]。而本研究同样发现六君安胃方中党参有效成分，即黄酮类化合物木犀草素和芹菜素，作为自由基清除剂和抗氧化剂，均具有抗突变、抗炎和抗病毒等作用。其中木犀草素具有很强的抗氧化和抗炎的作用，这也是它用于治疗结肠癌及其并发症的一个重要原因。木犀草素可能通过对iNOS和COX-2表达的抑制作用来防治CINV和CID[5]。芹菜素有细胞周期阻滞、细胞凋亡、抗炎和抗氧化作用，与其他黄酮类化合物相比，具有较强的抗炎作用，能够促进P38/MAPK 和PI3K-AKT 等多种抗炎途径，并能抑制核因子-κB、IκB降解和核移位，降低COX-2活性[6]。另外芹菜素可以通过肠道菌群代谢产物介导对CINV 和CID 起到抗炎活性和保护作用[7]。TAKEDA H 等[8]发现川陈皮素对5-HT2B 受体有很强的拮抗活性，Ki 值为0.21～0.59 mol/L。陈皮中的柚皮苷可显著降低结肠炎的严重程度，并促进结肠黏膜中促炎症介质的下调。有研究表明柚皮苷能够通过抑制巨噬细胞NF-KBP56 的活化减少结肠黏膜中炎性因子(TNF-α 和IL-6）、炎性介质(iNOS、Cox2、ICAM-1 和MCP-1）的产生[9]。柚皮苷抑制细胞因子发挥其抗炎作用，这与芹菜素等发挥作用的机制不同，后者是在转录水平调节细胞因子而发挥抗炎作用[10]。这也体现了中药复方治疗特定疾病过程中的多途径、多靶点的作用机制。

根据KEGG的分析结果，本研究发现六君安胃方中参与治疗CINV 和CID 的主要炎症通路为PI3K-AKt 信号通路、MAPK 信号通路和TNF 信号通路。PI3K-AKT信号通路被激活后主要影响胰岛素、生长因子和细胞因子，调节关键的代谢过程，并且在肠道炎症过程中发挥着重要作用[7，11]。参与促炎细胞因子应答的信号通路中最重要的是MAPK 和NF-κB 信号通路，其中MAPKs 中的JNK和P38 MAPKS 信号通路与细胞反应水平的组织损伤有关。NF-κB 信号通路有助于促进肠功能稳定，维护肠屏障的功能，促进创伤修复和组织再生，激活这些通路有助于肠黏膜修复和避免肠道损伤[12]。

化疗所致消化道不良反应如CINV 和CID，是大多数癌症患者在治疗过程中所面临的重要阻碍，并且是导致化疗延迟、减量，甚至终止的常见原因。现代医学认为，CINV 主要的发生机制是细胞毒性药物刺激肠道黏膜后引起黏膜损伤，导致肠嗜铬细胞局部释放5-羟色胺(5-HT），5-HT进一步与肠壁迷走神经传入终末的5-羟色胺3(5-HT3）受体相互作用，产生神经冲动，由迷走传入神经传入呕吐中枢导致呕吐。此外，神经递质多巴胺、P物质也在化疗所致呕吐过程中起着重要作用[13，14]。CID 的主要作用机制尚不完全明确，有证据表明CID是一个多因素影响的过程，化疗药物导致急性肠黏膜损伤(包括肠上皮细胞凋亡、肠壁浅层坏死和炎症）进而导致肠吸收和分泌失衡引起腹泻[15]。由此可见，化疗药物可直接杀伤肠黏膜细胞，导致肠道黏膜损伤，炎症介质释放，造成肠黏膜免疫功能紊乱进而导致消化道反应的发生[16]。通过上述研究，我们发现六君安胃方中的有效化学成分可能通过某些重要蛋白靶点调控上述通路，起到保护、改善肠道黏膜，避免肠黏膜损伤，从而实现防治CINV和CID的作用。

综上所述，本研究通过网络药理学分析了六君安胃方的有效化学成分、关键蛋白靶点、生物功能及通路之间的相互作用关系，并利用分子对接技术进行模拟对接，为六君安胃方的作用机制作了基本预测，为更好地理解中药复方干预化疗所致消化道不良反应及下一步基础实验研究提供了参考依据。