星点设计-响应面法优化柴胡皂苷提取工艺研究
2021-04-15赵艳丹赵艳洁李小阳宋丽华
赵艳丹，赵艳洁，李小阳，宋丽华
（1.锦州紫金药业有限公司，辽宁 锦州121001；2.中国人民解放军联勤保障部队第九六八医院，辽宁 锦州121001）
柴胡（Bupleurum chinense）为伞形科植物柴胡或狭叶柴胡的干燥根。柴胡始记于《神农本草经》，《伤寒论》为最早运用柴胡的医学类著作。柴胡具有解热、保肝、抗菌、抗肿瘤等作用［1，2］。《中华人民共和国药典》以柴胡皂苷a和柴胡皂苷d为指标控制成分，柴胡皂苷a和柴胡皂苷d是抗炎、抗病毒主要活性成分［3，4］。
响应面法是通过试验数据建立数学模型，筛选最优条件的统计分析方法。传统的单因素分析不考虑各因素之间的影响，响应面法可以评估各影响因素的相互作用，建立连续表面模型，预测结果与试验结果接近，在研究中得到广泛的应用［5，6］。响应面法优化提取工艺，可以评价各因素与响应值间的关系，使准确度提高，指导性强［7］。
目前，提取柴胡皂苷的方法主要有乙醇提取［8］，其提取效率高，但也存在溶剂残留问题。中药防病治病是中华民族几千年来宝贵的传承，多采用水煎法进行服用。本研究以中医理论为指导，采用传统水提工艺提取柴胡皂苷，以响应面法研究优化提取的因素，以便更好地发挥药效。
1 材料与方法
1.1 材料和仪器
样品和试剂：柴胡药材，来自山西省长治市，符合《中华人民共和国药典》的标准。柴胡皂苷a对照品（批号110777-200507，纯度为93.2%）、柴胡皂苷d对照品（批号110778-200505，纯度为97.3%）均购自中国食品药品检定研究所。乙腈、甲醇为色谱纯，氨水、正丁醇为分析纯。
L-2130型高效液相色谱仪、L-2455DAD型检测器（日本日立公司）。
1.2 方法
1.2.1 柴胡皂苷标准曲线的绘制精密称取柴胡皂苷a对照品与柴胡皂苷d对照品，加甲醇制成含柴胡皂苷a 1.93 mg/mL、柴胡皂苷d 2.43 mg/mL的溶液。再分别稀释得到含0.077、0.193、0.386、0.772、1.930 mg/mL柴 胡 皂 苷a，含0.097、0.243、0.486、0.972、2.430 mg/mL柴胡皂苷d的混合标准品溶液，以对照品的质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。
1.2.2 供试品溶液的制备取柴胡粉末10 g，加水80 mL，减压加热提取2次，每次1 h，过滤，合并滤液。用旋转蒸发仪浓缩，放冷。在-80℃冷冻干燥，制得柴胡皂苷提取物。取上述柴胡皂苷提取物，加水20 mL溶解，用饱和正丁醇60 mL萃取3次，再用5%氨水50 mL洗2次，分取饱和正丁醇并蒸干［9］，用甲醇10 mL溶解残渣，过滤，得到柴胡皂苷供试品。
色谱条件：Hypersil BDS C18色谱柱（250 mm×46 mm，5μm）；以乙腈为流动相A，水为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱程序为0～50 min（25%～90%A），50～55 min（90%A），55～60 min（90%～25%A）；流速为1.0 mL/min；柱温为30℃；检测波长为210 nm［10］。
1.2.3 柴胡皂苷类成分的单因素试验以柴胡皂苷类成分提取含量为指标，考察提取次数对柴胡皂苷类成分提取含量的影响，进行单因素分析，每组试验重复3次，取其平均值。
准确称取10 g柴胡粉末，放入烧瓶中，在提取温度80℃、液料比8∶1（mL∶g，下同），减压加热回流提取60 min的条件下，考察提取次数（1、2、3、4、5次）对柴胡皂苷类成分提取含量的影响。
1.2.4 响应面法优化柴胡提取工艺在单因素试验的基础上，应用Design-Expert 8.05软件，采用CCD（Central composite design）设计试验［11，12］。选择主要的3个影响因素：提取时间（A）、提取温度（B）、液料比（C）为自变量，柴胡皂苷类成分提取含量为因变量，每个因素设计5个水平，分别用-α、-1、0、1、α（α=1.682）表示，因素水平设计见表1。
表1 CCD设计影响因素和水平
1.3 数据处理
试验重复3次，采用Origin 75软件作图，采用Design Expert 8.05软件进行CCD响应面试验设计及分析。
2 结果与分析
2.1 柴胡皂苷标准曲线
柴胡皂苷a浓度与峰面积拟合的回归方程为Y=7 963.4X+59 797，R2=0.999 8；柴胡皂苷d浓度与峰面积拟合的回归方程为Y=8 137.1X-150.59，R2=0.999 7。柴胡皂苷a的质量浓度在0.077～1.930 mg/mL，柴胡皂苷d的质量浓度在0.097～2.43 mg/mL范围有良好的线性关系。
2.2 单因素试验结果
由图1可知，提取2次比提取1次柴胡皂苷类成分提取含量增加明显，提取第3、4、5次后柴胡皂苷类成分提取含量变化不大，从节约能源和缩短试验周期角度考虑，最终确定提取次数为2次。提取次数为非连续变量，未将提取次数作为后续优化因素。
图1 提取次数对柴胡皂苷类成分提取含量的影响
2.3 星点设计-响应面法优化提取工艺
2.3.1 模型拟合将数据用Design Expert 8.05软件进行响应面法分析，以柴胡皂苷类成分提取含量为响应值，分别对各影响因素进行多元线性回归和二项式方程拟合，试验结果见表2。对其数据进行分析后发现，用二阶多项式回归较优，得到柴胡皂苷类成分提取含量（Y）为响应值，3个参数（A、B、C）为自变量的二次回归方程模型为Y=-2.361+0.020A+0.057B+0.316C-1.25×105AB+6.25×105AC-6.25×105BC-1.569×104A2-3.511×104B2-0.019C2（r2=0.970 6，P＜0.01）。
表2 CCD试验设计方案及结果
2.3.2 方差分析和显著性检验采用Design Expert 8.05软件对表2的试验数据进行方差分析，结果如表3所示。
图2 提取时间与提取温度对柴胡皂苷类成分提取含量影响的响应曲面和等高线
表3 的回归方差分析结果表明，响应面的回归模型F=36.72，P＜0.000 1，说明该模型极显著。模型的失拟项F=4.13，P=0.073＞0.05，对柴胡皂苷类成分提取含量影响不显著，说明该模型回归方程不失拟，试验误差小，能充分反映实际情况，可用作模型分析。从表3还可以看出，因素一次项A和二次项A2、B2、C2对试验结果的影响显著（P＜0.05），交互项AB、AC、BC对试验结果的影响不显著（P＞0.05）。各因素对柴胡皂苷类成分提取含量影响程度依次为提取时间＞液料比＞提取温度。
表3 CCD方差分析结果
2.2.3 响应面分析与优化根据回归方程绘制响应曲面和等高线，分析提取时间、提取温度、液料比等因素及其交互作用对柴胡皂苷类成分提取含量的影响，结果分别见图2、图3、图4。
图3 提取时间与液料比对柴胡皂苷类成分提取含量影响的响应曲面和等高线
图4 提取温度与液料比对柴胡皂苷类成分提取含量影响的响应曲面和等高线
通过响应面坡度的陡峭程度、等高线椭圆形状可以反映出2个因素交互作用的强度。坡度平缓说明因素间交互作用弱。当条件改变时，对响应值影响不大。相反，坡面陡峭说明因素间交互作用强，当条件改变时，响应值变化大。等高线为椭圆形表示交互作用显著，接近圆形表示交互作用不显著。因此，由图2、图3和图4可知，提取时间和温度、提取温度和液料比、提取时间和液料比的交互作用都不显著，与上述方差分析和显著性分析相符。
2.3.4 验证试验对优化后的回归方程进行分析，在各试验因素水平范围内水提取柴胡皂苷类成分的最佳参数为提取时间63.33 min、提取温度78.99℃、液料比8.12∶1.00，在此最佳工艺条件下柴胡皂苷类成分的最大提取含量为1.81 mg/g。
为了验证回归模型的有效性，考虑试验的可行性、便捷性和可操作性，对预测的工艺参数进行微调，选择提取时间60 min、提取温度80℃、液料比8∶1，提取2次的条件下进行验证试验，柴胡皂苷类成分提取含量分别为1.80、1.79、1.82 mg/g，实际平均提取含量为1.80 mg/g，与预测值1.81 mg/g偏差较小。结果表明该模型合理，有效地对水提取柴胡工艺进行了优化。
3 小结与讨论
肖功胜等［13］采用单因素试验筛选主因素和水平，以正交试验筛选柴胡有效成分提取最佳工艺。Zhao等［14］研究了超声波辅助提取柴胡中柴胡皂苷的方法，考察了时间、温度、超声功率、粒径、溶剂固体比和溶剂浓度等因素对目标组分收率的影响，结果表明，超声波辅助提取的提取速度比传统的热提取快6倍。卫昊等［15］研究采用HPLC法测定秦岭柴胡及其不同溶剂提取部位中柴胡皂苷a和b的方法，结果表明，柴胡皂苷a在2.160～28.875μg/mL内线性关系良好，相关系数为0.999 9，平均回收率为98.31%，RSD为1.04%；柴胡皂苷b在0.144～1.800 μg/mL内线性关系良好，相关系数为0.999 9，平均回收率为97.00%，RSD为1.12%。本研究以中医理论为指导，以柴胡皂苷类成分提取含量为衡量指标，对提取次数进行了单因素考察，确定了提取次数为2次，同时明确了各影响因素的试验范围。采用传统水提工艺，以响应面法研究优化提取的因素，以便更好地发挥药效。
采用CCD响应面分析法进行柴胡皂苷提取工艺的优化，对试验数据进行回归拟合，P＜0.000 1，表明模型具有显著性。得到最佳工艺条件，提取时间60 min、提取温度80℃、液料比8∶1，提取2次。在此优化条件下柴胡皂苷类成分的实际提取含量为1.80 mg/g，与理论预测值1.81 mg/g较为接近。验证试验表明，试验建立的模型有较好的预测性，采用CCD试验设计-响应面法优化柴胡皂苷类成分的提取工艺可行。整个工艺流程操作方便，研究结果为柴胡皂苷类成分的进一步应用提供参考。
