澳洲坚果MiSTPP6基因克隆及低温胁迫下表达分析

蔡元保 杨祥燕 李季东 黄思婕 李穆 巫辅民

蔡元保（1981-），高級农艺师，主要从事果树分子生物学与遗传育种研究工作，主持国家自然科学基金项目、广西重点研发计划项目和广西自然科学基金等科研项目4项，并作为主要成员参与农业农村部行业科技专项、广西创新驱动发展专项等重大科研项目。以第一完成人或主要完成人获得省部级科技奖2项，地厅级科技奖4项;以第一发明人或第一完成人获得国家专利授权18项（其中发明专利6项）和计算机软件著作权登记6项。主持或主要参与广西地方标准2项，作物新品种登记5个;以第一作者或通讯作者在《南方农业学报》《植物学报》《植物生理学报》《植物遗传资源学报》等期刊上发表论文30多篇，并获得优秀论文13篇。

摘要：【目的】克隆澳洲坚果丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶（PP1）家族基因（MiSTPP6），并分析其不同组织及低温胁迫下的表达模式，为澳洲坚果PP1家族基因的抗寒分子机制提供理论依据。【方法】基于澳洲坚果转录组测序结果，利用RT-PCR技术克隆MiSTPP6基因，对其序列进行生物信息学分析，并利用实时荧光定量PCR检测其在不同组织及低温胁迫下的表达情况。【结果】从澳洲坚果中克隆获得MiSTPP6基因（GenBank登录号为MT374553），其cDNA全长2129 bp，最大的阅读框（ORF）长度为948 bp，编码315个氨基酸残基，含有PP1蛋白家族的典型结构域（MPP_PP1_PPKL）和特征性序列（LRGNHE）。MiSTPP6蛋白为稳定的亲水性蛋白，以丝氨酸磷酸化为主，可能定位于细胞质，属于非分泌型蛋白或膜蛋白，与已知植物PP1蛋白的氨基酸序列具有很高的相似性。MiSTPP6蛋白的二级结构由α-螺旋（占40.00%）、无规则卷曲（占32.38%）、延伸链（占18.41%）和β-转角（占9.21%），其三级结构与模板蛋白4v0u.1.A的结构相似度为80.60%，GMQE值为0.89。MiSTPP6基因在根、茎、叶、刚开放的小花和谢花后30～45 d的小果中均有表达，其中，MiSTPP6基因在刚开放的小花中的相对表达量最高。4 ℃低温胁迫后0.5～24.0 h，MiSTPP6基因在澳洲坚果苗期叶片中的相对表达量较对照明显下调，整体上呈持续下降的趋势。【结论】MiSTPP6属于PP1家族基因，具有组织表达特异性，可能在澳洲坚果抗寒分子机制中发挥重要的调控作用。

关键词： 澳洲坚果;蛋白磷酸酶;PP1;基因克隆;表达分析;低温胁迫

中图分类号： S664.903.6                          文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）12-3205-07

Cloning and expression analysis of MiSTPP6 gene from Macadamia integrifolia under cold stress

CAI Yuan-bao， YANG Xiang-yan*， LI Ji-dong， HUANG Si-jie， LI Mu， WU Fu-min

（Guangxi Subtropical Crops Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning  530001， China）

Abstract：【Objective】To clone serine/thonine protein phosphatase（PP1） family gene MiSTPP6 from macadamia （Macadamia integrifolia） and analyze its expression patterns in different tissues and cold stress，so as to provide scientific basis for the molecular mechanism of PPI family gene in response to cold stress. 【Method】Based on the transcriptome sequencing of macadamia， MiSTPP6 gene was cloned by RT-PCR and its sequences were analyzed by bioinformatics，and its expression in different tissues and cold stress was analyzed by real-time fluorescent quantitative PCR. 【Result】A new protein phosphatase gene MiSTPP6 was cloned from M. integrifolia （GenBank accession number was MT374553）. The full length cDNA and open reading frame （ORF） were 2129 bp and 948 bp，encoding 315 amino acidswith MPP_PP1_ PPKL domain and signature sequence （LRGNHE） belonged to the PP1 protein family. MiSTPP6 was a stable hydrophilic protein and mainly phosphorylated by serine，which might be located in the cytoplasm. MiSTPP6 was non-secreted transmembrane protein，which had high similarity with the amino acid sequence of known plant PP1 proteins. The secondary structure of MiSTPP6 consisted of α-helix （40.00%），random coil （32.38%），extended strand （18.41%） and β-turn （9.21%）.The similarity of tertiary structure between MiSTPP6 and the template protein 4v0u.1.A was 80.60%，and the GMQE value was 0.89. MiSTPP6 was expressed in different tissues （roots，stems，leaves，small flowers and small fruits 30-45 d after blossom falling） of macadamia，with the highest expression in opened flower. After low temperature （4 ℃） stress for 0.5-24.0 h，the relative expression of MiSTPP6 in macadamia seedling leaves was significantly down-regulated compared with the control，and the overall trend continued to decrease. 【Conclusion】MiSTPP6 belongs to PP1 family gene and has tissue expression specificity， it may play an important regulatory role in the molecular mechanism of response to cold stress in macadamia.

Key words： macadamia; protein phosphatase; PP1; gene cloning; expression analysis; cold stress

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31860537）;Guangxi Science and Technology Planning Project（GuikeAB19245008）;Basic Research Project of Guangxi Academy of Agricultural Sciences（Guinongke 2021YT154，Guinongke 2020YM56）

0 引言

【研究意义】蛋白磷酸酶是蛋白质可逆磷酸化过程中的两个关键酶之一，通过蛋白质去磷酸化修饰，从而改变目标蛋白的构象、生物学活性和稳定性（Tang et al.，2011;Miura et al.，2011;Casamayor and Ari?o，2020），因此，蛋白磷酸酶在植物新陈代谢、光合作用、信号转导、生长发育、蛋白质合成、细胞凋亡等生理生化过程中发挥重要的调控作用，尤其是与植物抗逆性密切相关（翁华等，2003;Ceulemans and Bollen，2004;Shi，2009）。澳洲坚果（Macadamia spp.）原产于亚热带雨林，被誉为“干果皇后”，其生长环境要求较高，其中气温是主要影响因素之一，若气温高于30 ℃或低于10 ℃均会严重影响其正常生长（Buthelezi et al.，2019;Herbert et al.，2019）。因此，研究澳洲坚果蛋白磷酸酶的功能对于揭示澳洲坚果的抗寒分子机制具有重要指导意义。【前人研究进展】蛋白激酶和蛋白磷酸酶的理化性质互为对立，在参与蛋白质的可逆磷酸化过程中，蛋白激酶催化蛋白的磷酸化反应，而蛋白磷酸酶催化去磷酸化反应（Barrero-Gil and Salinas，2013;阮班军等，2014）。其中，丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶（PPs）根据底物的特异性、金属离子的依赖性及其抑制剂的敏感性，可分为PP1和PP2家族（Luan，2003;Verbinnen et al.，2017）。目前，PP2基因家族的生物学功能及其调控机制研究较多，尤其是PP2A和PP2C亚家族。其中，PP2A基因在调控植物逆境胁迫中发挥重要作用，如PP2A作为关键调控基因可响应逆境胁迫（Khan et al.，2020），也可作为水杨酸靶基因抑制植物生长（Tan et al.，2020），还可调控植物的氧化应激信号转导（Máthé et al.，2019）;PP2C基因在植物脱落酸信号转导（Jung et al.，2020）和响应干旱胁迫和盐胁迫中发挥重要的调控作用（Krzywińska et al.，2016;Baek et al.，2019）。PP1家族蛋白是蛋白磷酸酶的一个重要分支，该家族蛋白的组成、结构、理化性质均与其他家族成员显著不同，但均在细胞信号传递过程中发挥重要作用。PP1家族蛋白的活性主要受内源抑制剂I-1和I-2的抑制，且主要作用于磷酸酶激酶的β亚基（Farkas et al.，2007）。目前，在豌豆（Guo and Roux，1996）、小麦（Vazquez-Tello et al.，1998）、水稻（Liao et al.，2016）、辣椒（Baek et al.，2017）和拟南芥（Zhang et al.，2020）等多种植物基因组DNA中已分离出PP1家族基因，且发现其在植物响应逆境胁迫中发挥重要调控作用。目前有关PP1家族基因在响应逆境胁迫的分子机制尚不清楚，有待进一步研究。【本研究切入点】目前有关澳洲坚果PP1家族基因克隆及功能分析的相关研究尚未见报道。【拟解决的关键问题】基于课题组前期的研究结果（蔡元保等，2013），从澳洲坚果中克隆PP1家族基因（MiSTPP6），对其序列进行生物信息学分析，并利用实时荧光定量PCR检测其在不同组织及低温胁迫下的表达情况，以期为澳洲坚果蛋白磷酸酶基因的抗寒分子机制及抗寒品种选育提供科学依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试品种为澳洲坚果（M. integrifolia）品种Own Choice（缩写为O.C.），取自广西亚热带作物研究所澳洲坚果种质圃。主要试剂：高保真酶Primer STAR Max DNA Polymerase、DNA凝胶回收试剂盒、ExTaq DNA聚合酶、DNA Marker和pMD18-T等购自宝生物工程（大连）有限公司;M-MLV反转录试剂盒购自美国Life公司;ChamQ SYBR qPCR Master Mix购自南京诺维赞生物科技有限公司。主要仪器设备：CFX96 Real-Time PCR System荧光定量PCR仪（Bio-Rad，美国）。

1. 2 样品处理及采集

收集O.C.嫁接苗（接穗为4个月苗龄）的根、茎和叶及刚开放的小花和谢花后30～45 d的小果。对O.C.幼苗进行4 ℃低温胁迫，分别处理0.5、1.0、3.0、6.0、12.0和24.0 h，对照组（CK）为未低温处理，试验重复3次，并收集这些叶片样品。

1. 3 总RNA提取及cDNA合成

取液氮速冻后的澳洲坚果样品，采用优化的CTAB改良法进行总RNA提取（蔡元保等，2014）。总RNA的浓度和纯度用核酸蛋白分析仪进行检测，其完整性利用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。以澳洲坚果样品总RNA为模板，参照M-MLV反转录试剂盒说明反转录合成cDNA第一链。

1. 4 MiSTPP6基因cDNA克隆

本课题组通过澳洲坚果抗寒转录组测序分析，筛选获得1个PP1家族基因序列，采用ORFfinder查找最大的开放阅读框（ORF），采用Primer Premier 5.0设计ORF两端引物（STPP6-F和STPP6-R）（表1），由深圳华大基因研究院合成。以澳洲坚果叶片cDNA为模板、STPP6-F和STPP6-R引物为引物进行PCR扩增。反应体系：2×Primer STAR Max 12.0 μL，10 μmol/L 正、反向引物各1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，无菌ddH2O补充至25.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性2 min;94 ℃ 35 s，58.3 ℃ 40 s，72 ℃ 75 s，进行34个循环;72 ℃延伸7 min;4 ℃保存。利用DNA凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物，并将目标条带连接至pMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素的固体培养基中挑取阳性克隆，送至深圳華大基因研究院进行测序。

1. 5 生物信息学分析

利用NCBI数据库的BLASTp对克隆基因编码的氨基酸序列进行同源比对分析，并用ORFfinder进行最大的ORF预测。采用SMART和PROSITE预测编码蛋白的功能结构域和功能基元;利用ProtParam预测蛋白的理化性质;通过NetPhos 3.1分析蛋白的磷酸化位点;以PSORT分析蛋白的亚细胞定位;利用SignalP 4.1预测蛋白的信号肽;采用TMpred预测蛋白的跨膜结构域;通过SOPMA和SWISS-MODEL进行蛋白的二、三级结构预测。在NCBI数据库的GenBank中搜索同源蛋白，利用DNAMAN 6.0进行蛋白的氨基酸序列多重比对分析，并用MEGA 5.1的邻接法（Neighbor-joining method，NJ）构建系统发育进化树（Bootstrap为1000次重复）。

1. 6 澳洲坚果MiSTPP6基因的表達模式分析

采用Primer Premier 5.0设计MiSTPP6基因的荧光定量引物QSTPP6-F和QSTPP6-R（表1）。利用BioRad CFX96荧光定量PCR检测MiSTPP6基因在澳洲坚果不同组织及低温胁迫下的表达情况，以澳洲坚果管家基因MADH为内参基因（杨倩等，2020）。反应体系：2×SYBR qPCR Master Mix 10.0 μL，cDNA模板1.0 μL，正、反向引物各1.0 μL，无菌ddH2O补充至20.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性3 min;95 ℃15 s，60.8 ℃或58.0 ℃（表1）25 s，72 ℃ 30 s，进行42个循环。每个试验重复3次。

1. 7 统计分析

采用Excel 2016进行数据处理和作图，采用2-ΔΔCt方法计算MiSTPP6基因的相对表达量（Livak and Schmittgen，2001）。

2 结果与分析

2. 1 MiSTPP6基因克隆结果

以澳洲坚果叶片cDNA为模板、STPP6-F和STPP6-R为引物进行PCR扩增。扩增片段测序结果和同源序列分析结果显示，该片段全长2129 bp，ORF长度为948 bp，编码315个氨基酸残基，与其他植物的PP1基因家族成员具有极高的相似性，说明扩增片段为PP1家族基因，将其命名为MiSTPP6，GenBank登录号为MT374553。

2. 2 MiSTPP6与其他植物PP1蛋白的序列比对结果

对MiSTPP6与其他植物PP1蛋白的氨基酸序列进行多重比对分析，结果表明MiSTPP6蛋白与已知植物PP1蛋白的氨基酸序列具有较高的相似性（图1），其中，与罂粟（Papaver somniferum）PsPP1-1蛋白（XP_026418403）高达92.70%，与姬蝴蝶兰（Phalaenopsis equestris）PePP1-1（XP_020590163）高达90.10%，与铁皮石斛（Dendrobium catenatum）DcPP1-1（XP_020673587）高达89.17%，与藜麦（Chenopodium quinoa）CqPP1（XP_021769065）高达88.50%。功能结构域预测分析结果显示，MiSTPP6含有PP1蛋白家族的典型结构域（MPP_PP1_PPKL）和特征性序列（LRGNHE）。

2. 3 MiSTPP6与其他PPs的系统进化分析结果

从GenBank中选择来源于不同植物的代表性PPs蛋白构建系统发育进化树，结果（图2）表明，20个PPs蛋白被分成PP1和PP2家族，其中，MiSTPP6属于PP1家族，与罂粟PsPP1-1（XP_026418403）、姬蝴蝶兰PePP1-1（XP_020590163）和铁皮石斛DcPP1-1（XP_020673587）的亲缘关系最近。

2. 4 MiSTPP6蛋白的理化特性分析结果

MiSTPP6蛋白分子式C1599H2502N426O464S19，分子量35.73 kD，理论等电点（pI）5.18，负电荷残基（Asp+Glu）和正电荷残基（Arg+Lys）分别为43和34个，不稳定指数Ⅱ37.48，脂肪系数95.65，亲水性系数-0.105，说明该蛋白为稳定的亲水性蛋白。

2. 5 MiSTPP6蛋白的磷酸化位点、亚细胞定位、跨膜域和信号肽预测结果

NetPhos 3.1分析结果（图3）显示，MiSTPP6蛋白的磷酸化位点高（分值大于0.5）的氨基酸有20个，其中丝氨酸10个，苏氨酸6个，酪氨酸4个，且这些磷酸化位点在该蛋白中的分布不均匀。PSORT预测结果表明，MiSTPP6蛋白定位于细胞质的概率较高，为65%。TMpred和SignalP预测结果显示，MiSTPP6蛋白不含跨膜域和信号肽序列，属于非分泌型蛋白或膜蛋白。

2. 6 MiSTPP6蛋白的二、三级结构预测结果

SOPMA预测结果可知，MiSTPP6蛋白二级结构由α-螺旋（占40.00%）、无规则卷曲（占32.38%）、延伸链（占18.41%）和β-转角（占9.21%）（图4）。以PP1（4v0u.1.A）为同源模板对MiSTPP6蛋白进行建模，结果（图5）显示，MiSTPP6蛋白与模板蛋白4v0u.1.A的结构相似度为80.60%，GMQE值为0.89，主要由α-螺旋、无规则卷曲和延伸链组成，与二级结构预测结果基本一致。

2. 7 MiSTPP6基因的表达分析结果

由图6可知，MiSTPP6基因在澳洲坚果的根、茎、叶、小花和小果中均有表达，其中MiSTPP6基因在刚开放的小花中的相对表达量最高，其次是小果，在茎中的相对表达量最低。由图7可知，4 ℃低温胁迫后0.5～24.0 h，MiSTPP6基因在澳洲坚果苗期叶片中的相对表达量较对照明显下调，整体上呈持续下降的趋势。

3 讨论

PP1由催化亚基和调节亚基组成的全酶。研究发现，动物基因组编码大约200个相互作用的PP1蛋白。但在植物中仅有少数PP1蛋白被报道（Zhang et al.，2020）。PP1家族蛋白的氨基酸序列及蛋白空间结构高度保守，含有典型的MPP_PP1_PPKL结构域（Casamayor and Ari?o，2020）。本研究从澳洲坚果克隆获得MiSTPP6基因，其编码的氨基酸序列含有PP1蛋白家族的典型结构域（MPP_PP1_PPKL）和特征性序列（LRGNHE），且与其他已鉴定的PP1蛋白具有极高的氨基酸序列相似性，并被聚类到PP1蛋白家族，推测MiSTPP6是PP1蛋白家族的新成员。由于PP1蛋白和其他家族的PPs一样，均是通过蛋白质去磷酸化修饰，在细胞信号转导、生长发育、新陈代谢等生命活动发挥重要作用（Kostich et al.，2002;Shi，2009）。MiSTPP6是稳定的亲水性蛋白，以丝氨酸磷酸化为主。根据氨基酸磷酸化修饰的作用（Barrero-Gil and Salinas，2013;阮班军等，2014），推测MiSTPP6蛋白可通过丝氨酸磷酸化修饰发挥重要的生物学功能。

已有研究表明，PP1家族基因在植物不同组织中广泛表达，其编码蛋白可定位于细胞的不同部位，以便于行使其生物学功能（Verbinnen et al.，2017）。如拟南芥PP1R3基因在不同组织中广泛表达，其编码蛋白又与Ⅰ型蛋白磷酸酶（TOPPs）共定位于细胞核和细胞质中（Zhang et al.，2020）。本研究发现，MiSTPP6基因在澳洲坚果的根、茎、叶、小花和小果等不同组织中均有表达，且其编码蛋白很可能定位于细胞质，故推测澳洲坚果MiSTPP6在细胞质中调控细胞的生长发育。

PP1家族基因在植物响应脱落酸（ABA）、干旱胁迫、盐胁迫等逆境胁迫中发挥重要的调控作用，如OsPP1a基因超表达可增强转基因水稻的耐盐性（Liao et al.，2016）;辣椒CaAIPP1与CaAIRF1互作以调控ABA信号和干旱胁迫响应（Baek et al.，2017）;拟南芥PP1R3介导ABA反应（Zhang et al.，2020）。本研究发现，澳洲坚果幼苗受4 ℃低温胁迫后，MiSTPP6基因的相对表达量整体上呈持续下降的趋势，因此，推测MiSTPP6可能作为负调控因子在澳洲坚果抗寒分子机制中发挥作用。由于MiSTPP6基因在其他逆境胁迫中的功能研究尚无报道。在后续研究中，应通过亚细胞定位、过量或反义表达等对MiSTPP6基因功能进行深入研究，对于了解蛋白质可逆磷酸化过程及其在澳洲坚果抗逆境胁迫的作用机制具有重要意义。

4 结论

MiSTPP6属于PP1家族基因，具有组织表达特异性，可能在澳洲坚果抗寒分子机制中发挥重要的调控作用。

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（責任编辑 陈 燕）