GC-MS 分析‘利王柚’果实黄皮层挥发性物质成分*

李文云，罗 怿，王小柯，韩秀梅，郑乾明，林 乾，蔡永强，李金强

（贵州省农业科学院果树科学研究所，贵阳 550006）

随着果实的成熟，会产生大量的挥发性物质，从而赋予果实独特怡人的风味。虽然成熟果实挥发性物质占果实总重的比率不足1%，但这些挥发性物质不仅是果实品质的重要组成部分，还成为影响消费者购买习惯的重要因素[1-2]。目前，已鉴定的植物挥发性物质超过23 000 种，以柑橘为原材料提取的精油具有宁神、止咳、消炎和清除自由基等多种功效，在食品、药品、化妆品等行业具有广泛的应用[3-4]。柑橘中挥发性物质种类主要包括单萜、倍半萜、萜类衍生物、酮、醛、酸、酯等，其中大部分为萜类，约占总挥发性物质含量的80%以上[5]。由于品种类型、成熟度、气候条件和栽培措施的差异，不同柑橘品种挥发性物质组成和含量存在较大的差异[6]。

‘利王柚’原产于贵州省铜仁市碧江区和平镇利王村，是由地方品种‘利王白柚’芽变选种得到的，其果肉呈现诱人的粉红色，口感酸甜，香味较‘利王白柚’浓郁[7-8]。本研究利用GC-MS 检测了‘利王柚’‘利王白柚’和‘金钱橘’成熟果实黄皮层挥发性物质组成，比较了挥发性物质成分和含量特征，以期为贵州省地方特色种质资源评价与利用及柑橘品质改良提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为‘利王柚’‘利王白柚’和‘金钱橘’，采样时选择至少3 株生长健壮、无病虫害的植株，从树冠外围随机采收15 个成熟果实带回实验室，用蒸馏水清洗果面，用手术刀小心分离果实最外层黄皮层，设置3 次重复，于液氮中速冻，随后置于-80 ℃超低温冰箱中保存待测。

1.2 试验方法

参照Liu 等柑橘果实挥发性物质提取方法[9]，称取0.2 g 分离好的黄皮层，加液氮研磨至细粉末状。加入500 μL 双蒸水，充分混匀。再加入500 μL 含壬酸甲酯的MTBE 溶液，充分混匀。于4 ℃超声提取30 min 后10 000 r/min 离心，吸取上清液，过滤膜至进样瓶中。利用 GC-MS 分离检测挥发性物质组分，进样体积设置为1 μL，仪器运行参数参照Liu等方法[10]。

1.3 数据分析

参照仪器自带挥发性物质数据库和物质特征离子数据，对挥发性物质进行定性；参照已知浓度内标（壬酸甲酯）峰面积推算目标物质的浓度。利用 Microsoft Office Excel 进行数据统计和作图。利用SPSS 进行差异显著性分析；对挥发性物质进行归一化处理后，利用R 软件OPLS-DA（正交偏最小二成判别分析）模型计算VIP 值（变量重要性投影）。

2 结果与分析

2.1 挥发性物质总离子流图

‘利王柚’‘利王白柚’和‘金钱橘’3 份材料黄皮层挥发性物质总离子流图见图1。根据挥发性物质数据库、物质特征离子碎片和内标物质浓度分别对物质进行定性和定量分析。从图1 可以直观地看出，3 份材料挥发性物质出峰时间、峰高和峰面积存在较大差异。

图1 ‘利王柚’‘利王白柚’和‘金钱橘’3 份材料挥发性物质总离子流图

2.2 挥发性物质种类分析

检测结果表明，共检测到72 种挥发性物质，主要包括单萜、倍半萜及其衍生物，以及醛、醇、酸、酯等（表1）。

表1 ‘利王柚’‘利王白柚’和‘金钱橘’3 份材料挥发性物质含量

按挥发性物质种类多少排序，依次为：倍半萜19 种、单萜12 种、单萜醇11 种、醛10 种、单萜醛4 种、单萜氧化物4 种、酯4 种、醇3 种、酸3种、单萜酮2 种。

续表1

3 份材料黄皮层挥发性物质个数见表2，其中‘金钱橘’检测到的挥发性物质总数最多，共50个；其次是‘利王柚’，检测到44 个；‘利王白柚’最少，仅检测到42 个。

表2 ‘利王柚’‘利王白柚’和‘金钱橘’3 份材料检测到的挥发性物质个数 个

从3 份材料挥发性物质占比来看（图2），单萜类所占的比重最大，占62.33%～92.01%；单萜衍生物（单萜醛、单萜醇、单萜酮、单萜氧化物）占2.96%～28.80%；倍半萜占1.29%～5.50%；其他类挥发性物质（醛、醇、酸、酯）仅占0.86%～4.76%。各类挥发性物质按占比高低排序，‘利王柚’依次为单萜（62.33%）＞单萜衍生物（28.80%）＞倍半萜（5.50%）＞其他（3.36%），‘利王白柚’依次为单萜（85.89%）＞单萜衍生物（8.05%）＞其他（4.76%）＞倍半萜（1.29%），‘金钱橘’依次为单萜（92.01%）＞倍半萜（4.17%）＞单萜衍生物（2.96%）＞其他（0.86%）。

图2 ‘利王柚’‘利王白柚’和‘金钱橘’3 份材料挥发性物质占比情况

2.3 挥发性物质含量比较分析

从检测的挥发性物质总含量来看（表1），‘金钱橘’最高，为4 098.87 µg/g，其次是‘利王柚’，为1 763.12 µg/g，‘利王白柚’最低，为852.42 µg/g，‘金钱橘’总含量分别是‘利王柚’和‘利王白柚’的2.32、4.81 倍。此外，单萜类、倍半萜类、单萜醇类和醛类4 类挥发性物质总含量‘金钱橘’黄皮层中最高，其次是‘利王柚’和‘利王白柚’。3份材料含量最高的挥发性物质均是单萜类，含量为734.73～3 771.80 µg/g，其中‘金钱橘’单萜总含量分别是‘利王柚’和‘利王白柚’的3.43、5.13 倍。倍半萜类是所检测的物质中种类最多的，倍半萜类总含量为11.04～171.11 µg/g，‘金钱橘’倍半萜总含量分别是‘利王白柚’和‘利王柚’的15.50、1.76 倍。从单萜衍生物来看，‘金钱橘’单萜醇总含量最高，为101.15 µg/g，分别是‘利王柚’和‘利王白柚’的1.36、5.81 倍。

单萜醛类、单萜酮类、单萜氧化物类、醇类、酸类和酯类6 类挥发性物质总含量均在‘利王柚’中最高。这6 类挥发性物质中，单萜酮类含量在‘利王柚’中最高。值得关注的是，柚类的特征香味物质诺卡酮含量在‘利王柚’和‘利王白柚’中极显著高于‘金钱橘’（P＜0.01），分别为406.38、39.19 µg/g，而‘金钱橘’中未检测到该物质。单萜醛类、单萜氧化物类、醇类、酸类和酯类5 类物质虽然占总挥发性物质的比率较低，但差异代谢物较多，其中‘金钱橘’未检测到醇类。

2.4 差异化挥发性物质

我们将3 份材料进行两两比较筛选差异挥发性物质，分组结果如下：‘利王柚’和‘利王白柚’、‘利王柚’和‘金钱橘’、‘利王白柚’和‘金钱橘’。样品质控数据和统计分析结果表明（表3），利用OPLS-DA 模型建立的R2值和Q2值均较高，此模型用于分析差异化挥发性物质的可信度较高。

表3 基于OPLS-DA 模型分组比较的R2和Q2值

从OPLS-DA 模型结果中，筛选VIP 值＞1 且差异显著性P＜0.05 的挥发性物质则为差异代谢物。3 份材料均可检测到的挥发性物质有α-蒎烯、β-蒎烯、崖柏烯、β-月桂烯、d-柠檬烯、吉玛烯B、α-布藜烯、β-柠檬醛、α-柠檬醛、芳樟醇、α-萜品醇、顺式-香叶醇、α-菖蒲烯醇、荜澄茄醇、顺式-芳樟醇氧化物、顺式-柠檬烯氧化物、反式-柠檬烯氧化物、己醛、2-己烯醛等，共19 种。

两两差异化挥发性物质比较分析结果表明（图3，表4～表6），差异代谢物的个数与柑橘种类密切相关。‘利王柚’和‘利王白柚’差异代谢物仅筛选到石竹烯、β-蒎烯、法呢醇等13 个差异代谢产物，其中上调12 个，下调1 个。而‘利王白柚’‘利王柚’与‘金钱橘’的亲缘关系较远，筛选到的差异代谢物较多。‘利王白柚’和‘金钱橘’共筛选到α-水芹烯、二十二碳六烯酸、反式-2-十二醛等24 个差异代谢产物，其中上调7 个，下调17个；‘利王柚’和‘金钱橘’共筛选到诺卡酮、顺式-香叶醇、反式-芳樟醇氧化物等27 个差异代谢产物，其中上调14 个，下调13 个。

图3 3 份材料两两比较差异挥发性物质个数

3 讨论与结论

挥发性物质是果实品质的重要组成部分，除了参与植物防御和辅助传粉外，提取的精油具有愉悦的香味，具有镇定、安神等多种功效，在临床、食品、美容等行业具有重要的应用[11-12]。挥发性物质由多种复杂的化合物质组成，其代谢途径涉及异戊二烯途径、莽草酸途径、脂肪酸裂解途径等多个复杂的通路，涉及的物质类型也较多[13]。本研究单萜类物质在所有挥发性物质中占比最大，这类物质具有抗肿瘤、缓解糖尿病、抑菌等多种生物学活性[14-15]。3份材料中，‘金钱橘’所检测到的挥发性物质种类最多，含量最高；钟炼军等[4]对12 个柑橘挥发性物质分析结果同样表明，橘类种类最多，含量最高。

果实挥发性物质因种类、品种、成熟度的不同而存在较大的差异，不同种类的柑橘都有其独特的挥发性物质构成并赋予果实怡人的香气[16]。芦柑挥发性物质以金合欢烯、正十一醛、紫苏醛等为主，脐橙挥发性物质以桧烯、月桂醛、3-蒈烯等为主[17]。

表4 ‘利王柚’和‘利王白柚’筛选的差异代谢物

表5 ‘利王白柚’和‘金钱橘’筛选的差异代谢物

表6 ‘利王柚’和‘金钱橘’筛选的差异代谢物

黄皮挥发性物质以β-水芹烯、d-柠檬烯、石竹烯、α-水芹烯、α-金合欢烯等为主[18]。差异代谢物筛选结果表明，差异代谢物的个数与柑橘类型息息相关，种类差异越大差异代谢物的个数越多。因‘利王柚’是来源于‘利王白柚’的芽变，都属于柚类，因此二者的挥发性物质成分更为相近，仅筛选到13个差异物质。而‘金钱橘’属于宽皮柑橘类，‘利王白柚’和‘金钱橘’、‘利王柚’和‘金钱橘’分别筛选到24、27 个差异物质，体现了不同种类柑橘积累挥发性物质特征，从而赋予不同柑橘种类具有其独特的香味。进一步分析结果表明，‘利王柚’和‘利王白柚’亲缘关系更近，同时也说明了利用挥发性物质可以作为区分柑橘种类的方法之一。与Yu 等[19]研究结果一致，他们在利用挥发性物质对橘、酸橙、血橙、温州蜜柑、克里曼丁橘等进行聚类分析时，能够将不同种类的柑橘明显区分开，并利用分子标记验证了该结果，说明了基于挥发性物质对柑橘种类进行分类的可靠性。