苯污染对大鼠脑组织环核苷酸与相关蛋白水平的影响

李登楼, 谢明仁

苯污染对大鼠脑组织环核苷酸与相关蛋白水平的影响

李登楼1, 谢明仁2,*

1. 甘肃政法大学网络空间安全学院, 兰州 730070 2. 甘肃政法大学公安技术学院, 兰州 730070

为了探索苯污染对人类健康损伤作用的因素, 选用SPF级Wistar大鼠为实验对象, 分为4组: 低剂量组灌胃苯 0.19 g·kg-1, 中剂量组灌胃苯 0.38 g·kg-1, 高剂量组灌胃苯 0.76 g·kg-1, 对照组灌胃菜籽油2 mL·kg-1;用酶联免疫吸附法(ELISA)检测脑组织中环核苷酸和相关蛋白的水平。结果发现, 连续给予大鼠不同剂量苯21 d, 低、中、高剂量大脑皮质cAMP、c-fos、Bax和caspase-9水平比对照组分别升高了22.41%—59.53%, 38.28%—81.34%, 29.08%—63.04%和44.53%—70.07%; cGMP、Bcl-2水平比对照组分别降低了15.20%—49.79% 和13.42%—46.98%。丘脑组织cAMP、c-fos、Bax和caspase-9水平比对照组分别升高了34.71%—63.34%, 28.32%—78.04%, 16.54%—49.46% 和9.10%—61.57%; cGMP、Bcl-2水平比对照组分别降低了20.00%—33.83% 和8.53%—39.53%。结果提示, 苯污染引起脑组织损伤和细胞凋亡主要与cAMP、c-fos、Bax、caspase-9水平升高及cGMP和Bcl-2水平降低有关。

苯污染; 脑组织; 环核苷酸; Wistar大鼠

0 前言

苯及苯系物(甲苯、苯酚、氯苯、二甲苯等)不仅严重污染人类及其他生物赖以生存的自然生态环境[1], 而且直接危害陆生动物[2]、水生动物[3]和人类的健康[4]。苯污染引起急性中毒[5], 造成神经系统[6]、造血系统[7]、生殖系统[8]严重危害, 出现头晕、头痛、咳嗽[9]和恶心等症状[10], 导致DNA损伤从而引起遗传毒性作用[11]。近年来随着分子生物学研究的进一步发展, 对c-fos、Bcl-2、bax和caspase 基因在细胞损伤、细胞凋亡信号传导过程中作用研究的进一步深入, 发现Bcl-2、bax基因不但可作为caspase基因的上游调控机制, 还参与对caspase活性的调节。鉴于苯污染的社会普遍性和对人类健康严重的危害性, 在提倡绿色生活、低碳环境的同时, 加强预防保护措施更为必要。本文为了探索苯污染与Bcl-2、c-fos、bax和caspase基因表达产物在组织器官和细胞损伤方面的关系, 用大鼠进行实验研究, 为苯的合理应用, 研究预防苯污染中毒损伤机制和环境治理提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物, SPF级Wistar雄性大鼠, 体重 180—190 g, 购于甘肃中医药大学科研实验中心[SCXK (甘)2015-0001]。全部实验均在甘肃省证据科学技术研究与应用重点实验室 SPF 级动物实验室完成, 实验动物使用许可证号: SYXK (甘)2015- 0006。苯: 分析纯 A.R, 天津市东丽区天大化学试剂厂生产,实验时用菜籽油稀释成所需浓度; 金龙鱼菜籽油: 陕西省咸阳市兴平食品工业园生产; c-fos、Bcl-2、Bax、cAMP、cGMP和caspase-9试剂盒: 上海酶联生物科技有限公司; 酶标仪: Thermo Scientific MK3 型酶标仪, 赛默飞世尔(上海)仪器有限公司生产。

1.2 方法

1.2.1 动物分组和给药

将40只Wistar大鼠随机分为4组, 每组10只。按苯对大鼠半数致死量(LD503.80 g·kg-1)的 1/5、1/10、1/20 给药量进行分组, 每组10只大鼠。低、中、高剂量组分别灌胃给于苯0.19、0.38和0.76 g·kg-1; 对照组灌胃给予菜籽油2 mL·kg-1。每天称重, 按重量给药, 观察动物活动状态, 连续给药21 d。

1.2.2 动物脑组织采集、检测

末次给药后次日, 全部动物用乙醚吸入麻醉, 无痛打开颅腔, 解剖出全脑,切取右侧大脑皮质和丘脑, 按试剂盒说明检测cAMP、cGMP、c-fos、Bax、Bcl-2和caspase-9水平。

1.2.3 直线回归方程制作

以试剂盒标准品的浓度为横坐标, 吸光度(OD)为纵坐标作出标准曲线的直线回归方程。

1.2.4 统计学处理

实验数据采用 SPSS 22.0 软件进行统计学处理。计数资料用百分率(%)表示, 组间比较用单因素方差分析,以<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 动物的一般状况

给药第7天后, 动物出现活动迟缓, 体重减轻, 体毛失去光泽、倒竖; 对照组动物未出现上述症状。

2.2 苯污染对大鼠大脑皮质环核苷酸水平的影响

cAMP标准曲线的直线回归方程为:=3.9×10-3+9.6×10-3,2=0.9996。将动物大脑皮质 OD 值代入直线回归方程, 测得低(965.02±0.55)、中(990.01±0.18)、高(1192.50±1.13)剂量组cAMP水平比对照组(747.5±0.86)分别升高了 29.09%、32.44%、59.53% (=762.2,0.01)。见图1。

cGMP标准曲线的直线回归方程为:=2.0×10-4+5.5×10-3,2=0.999。将动物大脑皮质 OD 值代入直线回归方程, 测得低(63.71±0.05)、中(60.64±0.07)、高(46.15±0.04)剂量组大鼠大脑皮质中cGMP水平比对照组(91.92±0.02)分别降低了30.70%、34.03%、49.79%(=200.2,0.01)。见图1。

2.3 苯污染对大鼠大脑皮质相关蛋白水平的影响

c-fos标准曲线的直线回归方程为:=1.0×10-2+1.01×10-2,2=0.999。将动物大脑皮质 OD值代入直线回归方程, 测得低(14.45±0.04)、中(15.95±0.11)、高(18.95±0.10)剂量组c-fos水平比对照组(10.45±0.05)分别升高了 38.28%、52.63%、81.34%(=612.8,0.01)。见图2。

图1 苯污染对大鼠大脑皮质环核苷酸水平的影响(与对照组比: **P<0.01)

Figure 1 Effect of benzene pollution on cyclic nucleotides levels in cerebral cortex of rats(**0.01control group)

Bcl-2标准曲线的直线回归方程为:=5.0×10-4+2.2×10-3,2=0.9995。将动物大脑皮质 OD 值代入直线回归方程, 测得低(211.02.00±0.14)、中(196.02.00±0.19)、高(158.02±0.06)剂量组Bcl-2水平比对照组(298.02±0.49)分别降低了 29.19%、34.23%、46.98%(=236.3,0.01)。见图2。

Bax标准曲线的直线回归方程为:=2.17×10-1+2.12×10-1,2=0.9997。将动物大脑皮质 OD 值代入直线回归方程, 测得低(128.01±0.05)、中(136.78±0.33)、高(161.69±0.32)剂量组Bax水平比对照组(99.17±0.11)分别升高了 29.08%、37.92%、63.04%(=333.6,0.01)。见图2。

caspase-9标准曲线的直线回归方程为:=1.5×10-3+2.19×10-2,2=0.9996。将动物大脑皮质 OD 值代入直线回归方程, 测得低(113.67±0.02)、中(133.66±0.24)、高(153.66±0.24)剂量组caspase-9水平比对照组(90.35±0.14)分别升高了 44.53%、47.94%、70.07%(=297.4,0.01)。见图2。

2.4 苯污染对大鼠丘脑组织环核苷酸水平的影响

将各组大鼠丘脑组织测定的OD值代入直线回归方程, 测得低(155.21±0.41)、中(172.23±0.20)、高(188.32±0.33)剂量组cAMP 水平比对照组(115.31±0.31)分别升高了 34.71%、49.46%、63.34%(=596.3,0.01); 低(66.08±0.07)、中(64.12±0.12)、高(66.08±0.18)组cGMP 水平比对照组(91.85±0.13)分别降低了 28.06%、30.19%、36.07%(=842.2,0.01)。见图3。

图2 苯污染对大鼠大脑皮质相关蛋白水平的影响(与对照组比: **P<0.01)

Figure 2 Effect of benzene pollution onrelated proteins levels in cerebral cortex of rats(**0.01control group)

2.5 苯污染对大鼠丘脑组织相关蛋白水平的影响

将各组大鼠丘脑组织测定的OD值代入直线回归方程, 测得低(29.45±0.09)、中(33.92±0.12)、高(40.86±0.20)剂量组c-fos水平比对照组(22.95±0.11)分别升高了 28.32%、49.76%、78.04%(=403.23,0.01); 低(182.02±0.09)、中(174.01±0.04)、高(156.01±0.07)剂量组Bcl-2水平比对照组(258.03±0.07)分别降低了29.46%、32.56%、39.53%(=305.4,0.01); 低(215.15±0.09)、中(228.07±0.28)、高(250.29±0.47)剂量组Bax水平比对照组(167.46±0.37)分别升高了28.48%、36.19%、49.46%(=745.99,0.01); 低(198.02±0.12)、中(207.01±0.05)、高(253.67±0.24)剂量组caspase-9水平比对照组(157.02±0.13)分别升高了 26.11%、31.84%、61.57%(=472.4,0.01)。见图4。

3 讨论

研究结果表明, 外界环境因素对生物组织器官的损伤受体内多种基因的参与和调控。c-fos基因是一种存在于正常神经元细胞核内的即刻早期应激基因,当机体受到环境刺激后,即刻引起c-fos蛋白的表达,其表达产物c-fos蛋白作为一类核蛋白转录因子, 与靶基因特异序列结合,导致组织细胞内生化反应的改变, 起到了第三信使[12]的作用。在调控细胞生长、分裂、增殖、分化乃至程序性死亡(凋亡)等方面发挥信使作用, c-fos表达可作为神经元接受伤害性刺激激活的标志。在一定程度上c-fos表达水平与所受刺激强度成正比。c-fos的表达影响了许多生命活动和过程,引起了人们的广泛关注[13]。尹柏双等在作动物麻醉实验时发现, 麻醉剂使大鼠大脑皮质内c-fos蛋白显著增加[14]。杜艳[15]采用艾灸方法刺激小鼠, 小鼠大脑皮层、海马组织c-fos蛋白的表达明显升高。童民锋等分别损伤大鼠颅脑后6 h和24 h, 大鼠脑外伤组损伤灶周围脑组织中c-fos蛋白表达明显增高[16]。Bax、Bcl-2共属于Bcl-2基因家族。Bcl-2是细胞凋亡抑制基因, Bax不仅拮抗Bcl-2的抑制凋亡作用, 而且具有促进细胞凋亡的功能。Bcl-2、bax表达蛋白位于线粒体上游, 是线粒体膜通透性改变的重要调控因素, 其过度表达能控制cyt-c的释放和下游caspase表达蛋白酶的活化, 介导组织器官的损伤和细胞的死亡。Bax和Bcl-2形成多聚体, 使细胞线粒体的通透性增强, 细胞色素c( cyt-c)等穿过线粒体膜, 进入细胞质, 与Caspase-9 结合加速细胞凋亡。李伟等[17]用对比剂建立肾病大鼠模型发现, 模型组大鼠出现广泛肾小管上皮细胞空泡样变性, 部分肾小管坏死; 肾间质纤维化, 肾细胞凋亡指数、Bax蛋白相对表达量显著高于对照组; Bcl-2蛋白相对表达量显著低于对照组。李攀登[18]用不同浓度的氢醌分别处理U937细胞24 h和48 h后, 细胞体积增大,胞浆中有空泡,胞核发生畸形, U937细胞的增殖抑制率、细胞凋亡率随氢醌作用时间及浓度的增加而增加,呈时间-剂量依赖性; 细胞Bax蛋白表达量增加, Bcl-2蛋白表达量减少, 细胞Caspase-3蛋白的表达量增加, 其机制与调控凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及Caspase-3的表达有关。杨双波[19]给予昆明种雄性小鼠100、400mg·kg-1苯35 d后处死, 小鼠睾丸组织结构损伤, 染毒浓度越高,病理损害越明显; 睾丸细胞Bcl-2下调, Bax表达上调,睾丸细胞凋亡率高于对照组, 并有量-效关系。于光艳[20]给于小鼠400、800和1600 mg·M-3气态苯连续染毒15 d, 小鼠骨髓边缘及中央处细胞数明显减少, 细胞凋亡率明显高于对照组, Bax、Cytc、Caspases-9、Caspases-3阳性细胞数随染毒剂量的增加而显著升高, 而Bcl-2阳性细胞数则明显低于对照组。研究发现[21], cAMP 是生物体内一种重要的调控信号分子, 是细胞内传递信息的第二信使。cAMP和cGMP 是相互拮抗的物质, 在正常生理状态下, 二者比值保持相对恒定, 否则可引起新陈代谢的紊乱, 导致机体损伤或病变[22]。实验结果发现, 连续给予Wistar大鼠苯0.19、0.38、0.76 g·kg-121 d, 大鼠大脑皮质和丘脑组织中cAMP水平、c-fos、Bax 和caspase-9蛋白水平随给药浓度的增加而显著升高, cGMP、Bcl-2水平随给药浓度的增加明显降低。实验结果与上述学者研究结果一致。实验结果提示, cAMP和c-fos、Bax、caspase-9蛋白具有促进细胞凋亡的作用, 是引起组织细胞损伤的主要因素, 凡能引起它们水平升高的体内外环境因素, 均可导致细胞凋亡和组织器官损伤; cGMP和Bcl-2具有抑制细胞凋亡的作用。实验结果表明, 苯污染使大鼠脑组织中cAMP、c-fos、Bax、caspase-9水平升高, cGMP、Bcl-2水平降低, 从而导致脑组织损伤和细胞凋亡。而c-fos、Bax、Bcl-2、caspase-9蛋白表达和cAMP、cGMP环核苷酸之间的相互联系和调节作用有待进一步探索。

图3 苯污染对大鼠丘脑组织环核苷酸水平的影响(与对照组比: **P<0.01)

Figure 3 Effect of benzene pollution oncyclic nucleotides levels in thalamus tissue of rats(**0.01control group)

图4 苯污染对大鼠丘脑组织相关蛋白水平的影响(与对照组比: **P<0.01)

Figure 4 Effect of benzene pollution on related proteins levels in thalamus tissue of rats(**0.01control group)

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Effects of benzene pollution on the levels of cyclic nucleotides and related proteins in rat brain tissue

LI Denglou1, XIE Mingren2,*

1. School of Cyberspace Security, Gansu University of Political Science and Law, Lanzhou 730070, China 2. School of Public Security Technology, Gansu University of Political Science and Law, Lanzhou 730070, China

In order to study the factors of benzene pollution on human health, SPF Wistar rats were selected as experimental materials and divided into four groups: the low-dose group was treated with benzene 0.19 g·kg-1; the medium-dose group was treated with benzene 0.38 g·kg-1; the high-dose group was treated with benzene 0.76 g·kg-1; and the control group was treated with canola oil 2 mL·kg-1. The levels of cyclic nucleotides and related proteins in brain tissue were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).The results showed that the levels of cAMP, c-fos, Bax and caspase-9 in the cerebral cortex of the rats were increased by 22.41%-59.53%, 38.28%-81.34%, 29.08%-63.04% and 44.53%-70.07%, respectively, when the rats were treated with different doses of benzene for 21 days. cGMP and Bcl-2 levels were reduced by 15.20%-49.79% and 13.42%-46.98%, respectively, compared with the control group. The levels of cAMP, c-fos, Bax and caspase-9 in thalamic tissues were increased by 34.71%-63.34%, 28.32%-78.04%, 16.54%-49.46% and 9.10%-61.57%, respectively, compared with the control group. The levels of cGMP and Bcl-2 decreased by 20.00%-33.83% and 8.53%-39.53%, respectively, compared with the control group. The results indicated that the brain tissue damage and cell apoptosis caused by benzene pollution were mainly related to the increased levels of cAMP, c-fos, Bax, caspase-9 and the decreased levels of cGMP and Bcl-2.

benzene pollution; brain tissue;cyclic nucleotides; Wistar rats

10.14108/j.cnki.1008-8873.2021.02.014

S592

A

1008-8873(2021)02-110-06

2020-03-30;

2020-04-20

兰州市科技计划项目(2018-1-17); 甘肃省青年科技基金项目(18JR3RA192); 甘肃政法学院青年项目(2017XQNLW13); 甘肃省司法鉴定中心项目(jdzxyb2018-10); 甘肃省高校科技创新团队项目(2016C-09)

李登楼(1989—), 女, 甘肃静宁人, 硕士, 实习研究员, 主要从事法医毒理学教学和研究, E-mail: tim9898@163.com

谢明仁, 男, 硕士, 副教授, 硕士生导师, 主要从事法医毒理学教学和研究, E-mail: xmr6700@gsli.edu.cn

李登楼, 谢明仁. 苯污染对大鼠脑组织环核苷酸与相关蛋白水平的影响[J]. 生态科学, 2021, 40(2): 110–115.

LI Denglou, XIE Mingren. Effects of benzene pollution on the levels of cyclic nucleotides and related proteins in rat brain tissue[J]. Ecological Science, 2021, 40(2): 110–115.