乳液中柔性界面蛋白构效关系研究

朱 颖 赵思明 王冬梅 江连洲 王中江 范志军

(1.哈尔滨商业大学食品工程学院，哈尔滨 150028; 2.东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030;3.黑龙江省北大荒绿色健康食品有限责任公司，佳木斯 154000)

0 引言

目前，水包油型乳液被广泛应用于化妆品、护肤品、制药和食品工业中。乳液是一种不稳定的液体，乳滴易发生絮凝和聚集甚至沉降等现象[1]。因此，一些表面活性剂被应用于降低界面张力并形成粘弹性保护层，从而抑制油滴的聚集[2]。蛋白质作为一种高效的食品乳化剂，具有亲水亲油性质。蛋白质的关键功能特性是通过吸附至油、水两相之间的界面处形成并稳定乳液，从而降低界面张力、增强界面膜的稳定性[3]。已有研究证明了油水界面吸收的乳蛋白层在稳定乳液中的作用[4-5]。鹰嘴豆蛋白是具有最高弹性模量的乳化剂，可以形成较小尺寸液滴，同时提高乳液的抗氧化性[6]。蛋白质在溶解过程中发生结构的解折叠，蛋白质构象的改变使疏水性残基暴露，从而改善了乳化性能[7-8]。文献[9]研究了蛋白质浓度对蛋白质乳液性质的影响，结果表明，乳液的流变行为取决于蛋白质的种类和浓度。蛋白质分子的柔性差异取决于不同程度的结构变化[10]。文献[11]从蛋白质的不同结构角度研究分子柔性与乳化性的关系。由于蛋白质对外界环境因素具有敏感性，故会因蛋白质结构的稳定性差异而影响蛋白质乳液的稳定性[12]。因此，对蛋白乳液稳定机理进行深入探究有利于拓宽其在工业生产中的应用范围。

界面蛋白的吸附是一个动态过程，蛋白分子吸附到油滴表面，形成不均一的蛋白膜。因此，界面蛋白可以在乳液中同时与油相和水相结合，包裹油滴，防止液滴聚沉，从而起到稳定乳液的作用。研究表明，乳液中界面蛋白的含量越高，越有利于降低油水界面张力，乳液稳定性越强[13-14]。界面蛋白的结构性质是影响乳液稳定性的重要因素，一些学者对此进行了相关研究[15-21]。蛋白质的界面功能性表达历经分子吸附、结构重排、界面扩张等复杂过程，从蛋白质的天然稳态结构难以分析界面功能性表达的构效关系，通过柔性结构分析、确定功能单位或结构域可为深入解析大豆蛋白界面功能性质提供可靠依据。

关于乳状液稳定性和蛋白质表面活性的研究较少，迄今为止，尚未见关于乳状液中界面蛋白柔性的相关报道。本文采用红外光谱、紫外光谱、荧光光谱分析不同品种大豆蛋白乳液中界面蛋白的结构特征，探究界面蛋白的柔性结构，通过分析不同品种界面蛋白的表面疏水性、二硫键含量、溶解性和乳化性等，对比界面蛋白的功能性，以期解析界面蛋白的柔性结构对功能性质的影响机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆分离蛋白，实验室自提；葵花籽油，市售；盐酸、氢氧化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠，北京新光化工试剂厂；正己烷、乙醇、甲醇，天津北科化学品有限责任公司；其他化学试剂均为分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

GL-20G-Ⅱ型高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器公司；FD5-3型冷冻干燥机，美国SIM公司；PHSJ-4A型实验室pH计，上海雷磁公司；电子分析天平(0.000 1 g)，北京赛多利斯仪器系统有限公司；ULTRA-TURRAX UTL2000型乳化机，德国IKA仪器设备公司；F-4500型荧光分光光度计，日本HITACHI公司。

1.3 界面蛋白提取

将大豆分离蛋白溶解在0.05 mol/L、pH值7.5±0.1的磷酸盐缓冲溶液中配置成1%的蛋白溶液，室温(20℃)下搅拌2 h，然后4℃静置充分后水和12 h。加入0.02%的叠氮化钠，防止微生物生长。按照葵花籽油与蛋白质质量比1～1.5加入葵花籽油，然后用FJ-200型高速均质器在20 000g下进行5 min均匀化，然后立即在50 MPa的压力下进行高压均匀化。制得的乳液用于以下研究。

界面蛋白的提取参照文献[22]的方法并进行了修改，将上述不同品种大豆蛋白乳液首先进行10 000g离心10 min，去上层乳液层添加4倍体积去离子水进行水洗30 min，然后20 000g高速离心20 min，取下层溶液进行酸沉(pH值4.5)得到蛋白沉淀，然后将沉淀后的蛋白碱溶(pH值8.0)，冻干得到界面蛋白。

1.4 指标测定

1.4.1界面蛋白含量测定

参照文献[23]的方法测定不同品种大豆蛋白乳液界面蛋白含量。将乳液样品在室温15 000g的条件下离心40 min，使样品乳液分层。顶部是乳液油层，底部是蛋白水相。使用牛血清蛋白作为标准物，通过文献[24]方法测定底部溶液和初始蛋白溶液的蛋白浓度，界面蛋白质量分数计算式为

(1)

式中CI——最初乳液中总的蛋白质量比，g/g

Cs——上清液中的蛋白质量比，g/g

1.4.2界面蛋白氨基酸组成测定

氨基酸组成测定参照文献[25]的方法。使用Hitachi L-8800型自动氨基酸分析仪(德国曼默博尔公司)测定氨基酸组成。在110℃下将蛋白质样品在密封管中用6 mol/L HCl水解24 h。水解后将溶液进行冻干处理，复溶过滤待用。在38℃下进行测定，检测波长为254 nm，流速为1.0 mL/min。样品氨基酸组成用氨基酸占蛋白质质量分数来表征。

1.4.3红外光谱分析(FTIR)

界面蛋白的红外光谱测定参照文献[26]的方法。FTIR光谱在波长4 000～400 cm-1范围内进行扫描，界面蛋白研磨成粉末，并在室温下利用KBr进行压片(每1 mg蛋白使用100 mg KBr)。每个光谱平均扫描60次，分辨率为2 cm-1。酰胺I带的分析在1 700～1 600 cm-1的区域内进行。蛋白的二级结构由“peak fitting”软件进行拟合获得。

1.4.4十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)

SDS-PAGE根据文献[27]方法进行实验，配制12%的分离胶和5%的浓缩胶。将溶解好的大豆分离蛋白(6 mg/mL)与上样缓冲液混合后沸水浴5 min，3 000g离心5 min后上样到凝胶中。浓缩胶先以80 mV进行跑胶，然后在分离胶中以120 mV进行电泳，直到到达凝胶底部为止。电泳完成后，将凝胶用0.05%考马斯亮蓝(R-250)染色，染色时间为30 min，最后用脱色液(甲醇、冰乙酸、水，体积比1∶1∶8)洗脱至条带清晰。使用Molecular Imager Gel Doc(美国加利福尼亚州Bio-Rad实验室)分析凝胶条带并进行拍摄。

1.4.5荧光光谱分析

采用F-4500型荧光分光光度计(日本HITACHI公司)对样品进行荧光光谱测定。将不同品种的SPI(大豆分离蛋白)溶液稀释，使其质量浓度达到0.2 mg/mL。光谱测定条件设置为：激发波长(Ex)280 nm，扫描波长(Em)为300～500 nm，激发狭缝宽度(Ex Slit)为5 nm，同样发射狭缝宽度(Em Slit)也为5 nm。重复扫描3次。

1.4.6紫外扫描

将界面蛋白溶液稀释到0.1～0.2 mg/mL进行紫外光谱扫描，波长范围 250～350 nm，扫描速率100 nm/min，分辨率为 0.2 nm，重复扫描3次记录平均值。

1.4.7表面疏水性分析

参照文献[28]的方法，使用疏水性荧光探针8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)测定表面疏水性。在0.01 mol/L磷酸盐缓冲盐水(pH值7.0)中制备8×10-3mol/L ANS溶液和0.01 g/mL蛋白质溶液。取5 mL蛋白溶液加入50 μL 10 mmol/L的ANS溶液。将混合物涡旋振荡约5 s。在(20±5)℃条件下，使用Tecan M200 PRO(美国普洛麦格公司)设置激发波长(Ex)为390 nm，扫描波长(Em)为468 nm，激发和发射狭缝宽度(Ex Slit和Em Slit)为5 nm，扫描速率(Scan spe)为10 nm/s。以荧光值为因变量，SPI质量浓度为自变量作图，得到的一次函数拟合线的初始斜率为表面疏水性指数。

1.4.8二硫键含量测定

SPI中-SH和-SS含量参照文献[29]的方法测定。在0.5 mL的样品溶液中加入2.5 mL含有8 mol/L Urea(尿素)的Tris-甘氨酸缓冲液和0.02 mL含有1% DNTB(5,5′-二硫双-2-硝基苯甲酸)的Tris-甘氨酸缓冲液，将其置于40℃水浴中保温25 min。利用双光束分光光度计(日本HITACHI公司)在412 nm处测量其吸光度。Tris-甘氨酸缓冲液作为空白对照。-SH和-SS质量摩尔浓度计算公式为

(2)

式中A412——412 nm处的吸光度

C——样品质量浓度，mg/mL

D——稀释因子，-SH取5.02，-SS取10

1.4.9界面蛋白溶解性测定

应用BCA测定法测定蛋白质浓度。将含有Cu2+和BCA试剂的工作液添加到梯度标准溶液(每1 mL PBS缓冲溶液中有5 mg牛血清白蛋白)及200 μL蛋白样品的96孔板中，并于37℃保温30 min。采用Tecan M200 PRO型酶标仪记录在562 nm处的吸光度，溶解度计算公式为

(3)

式中Cu——上清液蛋白质量浓度

Ct——总蛋白质量浓度

1.4.10界面蛋白乳化性质测定

根据文献[30]的方法，测定乳化性指数(EAI)和乳化稳定性指数(ESI)。将葵花籽油和蛋白质溶液(0.2 mg/mL)以1∶3的体积比放入烧杯中，然后使用Ultra-Turrax T18型均质器将其均质化3 min。然后立即用0.1%SDS将50 μL乳液稀释100倍。使用分光光度计(上海SHJH有限公司)记录500 nm处和10 min后的吸光度。EAI和ESI计算公式为

(4)

(5)

式中EAI——乳化性指数，m2/g

ESI——乳化稳定性指数，min

L——比色皿的光路长度，取1 cm

θ——乳液的油相分数，取25%

A0、A10——乳液在0、10 min的吸光度

1.5 数据统计及分析

所有的实验至少进行3次，利用SPSS Statistics软件对数据进行ANOVA差异显著性分析。采用Origin 9.1软件、PeakFit 4.12分析软件对数据进行处理。

2 结果与讨论

2.1 界面蛋白含量

前期研究[31]确定12种蛋白的柔性从大到小依次为HH-53、HN-87、HN-48、HN-44、HN-61、HN-52、HH-49、JY-55、HN-85、HN-66、HN-69、HH-51(HH代表黑河品种大豆，HN代表黑农品种大豆，JY代表金源品种大豆)。柔性较高的蛋白以较快的吸附速率吸附到水油界面处，增加乳液中界面柔性蛋白的含量。图1(图中不同字母表示差异显著，下同)显示了不同品种蛋白乳液的界面柔性蛋白质量分数，HH-53、HN-87、HN-48和HH-44蛋白制备的乳液含有超过50%的界面柔性蛋白，而HN-66、JY-55、HN-85和HN-61蛋白乳液含有40%～50%的界面蛋白，HN-52、HH-49和HH-51蛋白乳液中界面蛋白质量分数在40%左右。这说明仍有很多未吸附的蛋白分子存在于水溶液中。柔性蛋白会增加油滴表面的吸附蛋白含量，有利于界面分子间的相互作用，从而提高乳液的稳定性。文献[32]研究表明，界面蛋白含量越高，乳液越稳定。

2.2 界面蛋白氨基酸组成

已知大豆蛋白包含人体所需的8种必需氨基酸，界面蛋白和大豆分离蛋白的氨基酸组成差异不大。通过表1比较可知，HN-48和HN-87界面蛋白含有较多的疏水性Leu和Phe，这可能与HN-48和HN-87蛋白构成的乳液的稳定性有相关性。蛋白柔性较高，会导致含更多疏水性氨基酸的蛋白吸附在水油界面，形成稳定的界面膜。而HN-69、HN-52和HN-61含有更多的酸性氨基酸Glu和Asp，导致分子间斥力增加，这可能是导致其界面蛋白柔性较低的原因。HN-61、HN-66、HN-69和HN-85界面蛋白的碱性氨基酸Lys显著低于其他品种界面蛋白，这与本团队之前研究[31]的氨基酸分离组成对柔性蛋白的影响保持一致。柔性蛋白具有的氨基酸组成特点决定了柔性蛋白质的结构[33]。文献[34]研究证实疏水性和带电性氨基酸的分布将影响蛋白质分子的柔性，进而影响蛋白质的功能性质。文献[35]的实验结论进一步证明了课题组的实验结果，在相邻多肽链分布的疏水性和带电荷氨基酸残基趋向于重排并暴露在蛋白质分子的表面。

表1 不同品种界面蛋白的氨基酸质量分数Tab.1 Content of different amino acids in different interface proteins %

2.3 界面蛋白二级结构

傅里叶红外光谱(FTIR)是一种用来分析蛋白质结构特征的光谱方法[36]。不同品种界面蛋白的红外光谱图见图2，采用Gauss面积法拟合对界面蛋白的酰胺Ⅰ带(1 700～1 600 cm-1)红外谱图进行二阶求导，可计算得出界面蛋白的二级结构相对含量，如表2所示。不同品种的界面蛋白均以β-折叠结构为主，其中柔性较高的HN-87、HN-48、HH-44和HH-53界面蛋白含有较多的无规则卷曲结构和较低含量的α-螺旋结构。这4种界面蛋白所含有的柔性结构较多，更有利于在界面处展开，稳定乳液。文献[37]研究证明，α-螺旋位于多肽链骨架的内部，与蛋白质的稳定性相关，而无规则卷曲结构更多地与蛋白质的柔性相关。因此，界面蛋白内部骨架稳定性降低，其柔性结构增加，更有利于吸附到水油界面处。

表2 不同品种界面蛋白的二级结构相对含量Tab.2 Secondary structure content of different interface proteins by FTIR %

2.4 界面蛋白亚基组成

不同品种界面蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析见图3(图中M表示标准品Marker)。大豆分离蛋白由7S和11S蛋白组成，共多个不同分子质量的亚基。而界面蛋白的结构组成中差异较大，部分条带颜色深且宽，部分条带较浅，这是由于在稳定乳液后的蛋白中部分蛋白无法进入电泳槽。其中HN-69、HH-49和HN-52界面蛋白条带颜色最浅，这3种蛋白的柔性较差，因此吸附在界面处的含量较少导致在提取过程中含量低。也有可能是因为界面蛋白在提取过程中存在少许的交叉污染[38]。经离心后的JY-55、HH-51、HN-66、HN-85、HN-61界面蛋白组成中11S蛋白含量较高，而HH-53、HN-48、HH-44、HN-87界面蛋白中7S蛋白比重增加。7S蛋白的结构柔性高于11S蛋白，二者的比重将影响界面蛋白的结构组成，进而影响其功能性质表达。

2.5 界面蛋白表面疏水性

目前研究学者认为，蛋白质吸附于水油界面后，蛋白质界面层的流变性质主要来自于疏水相互作用和二硫键的贡献[39]。不同品种界面蛋白的表面疏水性如图4所示，反映了界面蛋白的结构和表面活性。HN-87、HH-53、HN-48和HH-44界面蛋白含有较高的表面疏水性基团，而HN-69、HN-66、HN-52和HN-61界面蛋白的表面疏水性较低，这与蛋白在水油界面的稳定性相关。界面蛋白的折叠结构减少，使埋藏在分子内部的疏水性位点暴露出来，吸附在水油界面深入到油相内部，形成比较牢固的蛋白膜来稳定乳液，提高蛋白质的乳化性能。文献[40]的研究结果同样表明，当蛋白分子更易舒展，柔性较高时，其疏水性相对较高，一定程度上维持乳液的稳定。

2.6 二硫键含量分析

不同品种界面蛋白的二硫键含量如图4所示。二硫键对于稳定蛋白质起重要作用，一般二硫键数目越多，蛋白结构的稳定性越强，柔性较差[41]。HN-87、HH-53、HN-48和HH-44界面蛋白二硫键含量较高，其他品种的界面蛋白也存在较大差异(P>0.05)。这是由于二硫键存在于蛋白质分子内和分子间。在界面蛋白吸附到油滴表面形成蛋白膜，这些蛋白质分子间就通过二硫键结合，才能形成稳定的蛋白质，增强膜的强度。与此同时，蛋白质中的疏水残基多数围绕蛋白质中的二硫键形成疏水区域[42]，这也导致界面蛋白形成稳定的乳液。

2.7 界面蛋白荧光光谱分析

由于蛋白分子中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸残基能够吸收发射荧光，而色氨基残基的变化程度及其微环境情况反映了蛋白质的结构变化。由图5可以看出，不同品种大豆界面蛋白的最大吸收峰均大于330 nm，说明所有界面蛋白的色氨酸残基均分布在蛋白质分子外部极性环境中。HH-51、HN-61、HN-66和HN-69界面蛋白的最大吸收峰小于330 nm，说明这4种界面蛋白的更多色氨酸残基位于蛋白质分子内部，结构柔性较低，不易打开暴露。HH-53、HN-52和HH-49界面蛋白的最大吸收峰位于330 nm，而HN-87、HN-85、HN-48、JY-55和HH-44界面蛋白吸收峰大于330 nm，均出现了红移现象，说明这些界面蛋白的结构柔性较高，更易伸展暴露，使更多的色氨酸残基暴露在蛋白质分子的外部，形成疏水残基，使得界面蛋白柔性更高，更易吸附在水-油界面，防止油滴聚集，从而稳定乳液。由于红移的程度反映蛋白质构象的差异程度，红移程度越大，说明蛋白质色氨酸极性越强，导致蛋白质表面疏水性越大[43]。所以HN-48、HH-44和JY-55界面蛋白的红移幅度更大，说明蛋白分子结构更加松散，结构柔性更强，更易暴露内部的氨基酸残基。这与界面蛋白表面疏水性的结果一致。

2.8 界面蛋白紫外-可见吸收光谱

紫外-可见吸收光谱是一种非常简单、实用的，用于探究蛋白质结构的方法。由于蛋白质侧链含有的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基等芳香族氨基酸，会产生不同的紫外吸收峰，从而反映蛋白质的三级构象的变化[44]。由图6可知，界面蛋白在290 nm左右处出现了峰值。HN-69、HN-61、HH-51和HH-44界面蛋白的峰值低于其他品种的界面蛋白，界面蛋白发生了红移，说明蛋白质中的酪氨酸更多地暴露于极性环境中，而色氨酸更多地趋向于埋藏在蛋白质分子内部。

2.9 界面蛋白溶解性

蛋白质的溶解性与乳化性质有着密切关系，不同品种界面蛋白的溶解性如图7所示。12种界面蛋白的溶解性较差，且具有显著性差异(P<0.05)。由于界面的提取是从蛋白质乳液中分离得到的，含有少部分的油脂残存。另外，界面蛋白的结构特征表明，界面蛋白结构稳定，且含有较多的疏水性氨基酸，使得溶解性降低。这与上述对界面蛋白的表面疏水性的分析结果相同。

2.10 界面蛋白乳化性质

柔性较高的HN-87、HH-44、HH-53和HN-48界面蛋白表现出更好的界面性质(图8)。不同品种界面蛋白的乳化稳定性差异不大，较分离蛋白相比有所降低。这可能是由于界面提取后蛋白质的结构发生了变化，在稳定蛋白膜上失去了原本稳定的结构，导致乳化稳定性降低。对比前期对大豆分离蛋白的乳化性质的测定[31]，进一步确定界面蛋白是柔性最高的柔性蛋白，表面拥有较高的疏水性基团，有利于吸附在水油界面，增加蛋白质分子间的相互作用。文献[45]的研究结果表明，表面疏水性是影响分析蛋白质乳化性质的主要参数，本文研究结果与其相吻合。结合上述界面蛋白结构特征的分析，可以确定蛋白质结构的改变会极大影响界面学性质。

3 结束语

探究了不同品种大豆界面蛋白的结构特征和界面学性质。结果表明：柔性蛋白更易吸附到水油界面，且增加界面蛋白的吸附量，形成的乳液稳定性增加。这与其氨基酸组成存在相关性，疏水性氨基酸含量决定了柔性界面蛋白与水分子的相互作用，与表面疏水性呈现相同趋势。界面蛋白的α-螺旋结构含量较低，无规则卷曲结构含量增加。界面蛋白中7S亚基的柔性较高。紫外光谱和荧光光谱分析表明，柔性界面蛋白分子的结构易伸展，使内部的疏水性基团暴露出来，且界面蛋白分子的二硫键多在疏水基团附近形成，从而降低了界面蛋白的溶解性，增加其界面学性质。