基于UPLC-MS/MS技术对蓝莓中花青苷类物质的定性定量分析

魏海蓉，易锡斌，谭钺，徐丽，宗晓娟，朱东姿，刘庆忠，王甲威，张力思

（1.山东省果树研究所/山东省果树生物技术育种重点实验室，山东 泰安 271000；2.济南磐升生物技术有限公司，山东 济南 250102）

蓝莓属于杜鹃花科（Ericaceae）越桔属（Vaccinium）的一种浆果类果树，富含花青苷、熊果酸、黄酮等抗氧化物质，具有改善视力、增强记忆力、软化血管、抗癌等多种保健功能，倍受消费者的青睐［1，2］。蓝莓果实富含的花青苷是一大类非常重要的功能性成分，随着对其生物学活性功能研究的不断深入，蓝莓花青苷越来越多地被开发应用于食品、药品和化妆品领域，具有广阔的发展前景。

花青苷是一种广泛存在于植物体中的水溶性天然色素，属于一类具有多个酚羟基的天然黄酮类化合物，具有抗氧化、清除自由基、抗炎、抗肿瘤、调节免疫、改善血液循环和预防心血管疾病等多种生物活性［3-5］。花青苷的化学结构决定其生物学功能，不同种类花青苷因与花青素结合的糖基种类、位置和数量不同，结构存在差异，具有不同的生物学活性。因此，研究蓝莓果实花青苷类物质的组成和含量，对综合开发蓝莓相关产品具有重要意义。

目前人们对花青苷代谢途径及调控机理的研究较为深入，但是对其发挥生理功能活性所涉及的分子结构及花青素的修饰、转运过程等方面还比较少［6，7］。目前常用的花青苷检测方法主要有紫外可见分光光度法、液相色谱法和液相色谱串联质谱法［8-10］。其中，高效液相色谱串联质谱法在快速分离、准确定性和灵敏度等方面较前两者更具有优势。本研究以超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱（UPLC-MS/MS）技术对3个蓝莓品种成熟果实中花青苷组分的种类和含量进行比较分析，旨在为蓝莓优异种质挖掘和蓝莓花青苷产品的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

本试验所用高灌蓝莓品种‘蓝丰’（Vaccinium corymbosum‘Bluecrop’）和‘喜来’（V.corymbosum‘Sierra’）以及兔眼蓝莓品种‘蓝冠’（Vaccinium ashei Read‘Lan Guan’）的成熟果实均采自山东省果树研究所试验基地。从健株上随机选取无病虫害、无机械损伤、充分发育成熟的果实，切碎，液氮速冻，存于-80℃冰箱，用于测定。

乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯。花青苷标准物质包括飞燕草素-3-半乳糖苷、锦葵素-3-阿拉伯糖苷、飞燕草素-3-葡萄糖苷、锦葵素-3-半乳糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷、牵牛花素-3-葡萄糖苷、牵牛花素-3-半乳糖苷、矢车菊素-3-芸香糖苷、芍药素-3-芸香糖苷、芍药素-3-半乳糖苷、矢车菊素-3-阿拉伯糖苷。

1.2 仪器与设备

Triple Quad 4500液相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪；超纯水仪；Phenomenex kinetex C18色谱柱；旋转蒸发仪；TH-100BQX型数控超声波清洗机。

1.3 花青苷提取

取鲜样0.5 g，加液氮研磨，转入50 mL离心管中，加入甲醇-0.1%甲酸（2∶8，V/V）提取液15 mL，室温下超声波提取10 min，然后置于4℃条件下浸提24 h，再4℃下12 000 r/min离心15 min，收集上清液，35℃旋转蒸干，用甲醇-0.1%甲酸水溶液回溶，并定容至2 mL。采用0.22μm有机微孔滤膜过滤后装入2 mL进样瓶，待上机测定。

1.4 色谱与质谱条件

1.4.1 色谱条件 色谱柱Phenomenex Kinetex（100 mm×4.6 mm，2.6μm），流动相A 0.1%甲酸水溶液，流动相B乙腈，进样量5μL，流速1.0 mL/min，柱温35℃。采用梯度洗脱：0～1.0 min，5% B；1.0～2.5 min，5% ～50% B；2.5～3.8 min，50%～70% B；3.8～5.0 min，70%～90% B；5.0～6.0 min，90% B；6.0～6.2 min，90% ～5%B；6.2～8.0 min，5% B。

1.4.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI），正离子扫描模式；多重反应监测（MRM）参数：气帘气241.325 kPa，离子源电压5 500.00 V，离子源温度550.00℃，离子源电离反应气体379.225 kPa，脱溶剂气体379.225 kPa，碰撞池气体48.265 kPa。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

花青苷类物质在C18色谱柱上能够得到很好的分离［11，12］。因此本试验选用Phenomenex Kinetex C18（100 mm×4.6 mm，2.6μm）色谱柱，根据花青苷类物质结构复杂、酸性条件下较为稳定、极性较强且差异较小的特性，对流动相组成、流速、梯度洗脱程序进行优化。确定流动相A采用弱酸性的0.1%甲酸水溶液，流动相B采用乙腈，进样量5μL，流速1.0 mL/min，柱温35℃，梯度洗脱。在此条件下能够较好地分离和检测出11种化合物。总离子流图见图1。

图1 花青苷类物质的总离子流图

2.2 质谱参数优化

在电喷雾正离子模式下对化合物标准溶液进行母离子Q1扫描。飞燕草素-3-半乳糖苷、飞燕草素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-阿拉伯糖苷、锦葵素-3-半乳糖苷、芍药素-3-半乳糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷、芍药素-3-芸香糖苷、牵牛花素-3-半乳糖苷、锦葵素-3-阿拉伯糖苷、牵牛花素-3-葡萄糖苷和矢车菊素-3-芸香糖苷11种化合物的母离子均以［M+H］+或［M］+形式存在。确定母离子后，再对母离子进行二级质谱扫描。通过对二级质谱参数如锥孔电压、碰撞能量等进行优化，确定每种物质选择3个信号较强子离子与母离子组成检测离子对，采用MRM检测模式对待测物进行定性和定量检测。试验表明，DP电压35～90 V时Q1丰度几乎不变；DP较高时异构体的丰度有所差异，为了不影响异构体的丰度，选择40 V作为最终DP电压，碰撞池入口电压（EP）、出口电压（CXP）分别为12、9 V。11种花青苷在色谱柱上的相对保留时间、定性离子对及质谱参数见表1。

表1 MRM监测模式下11种花青苷类物质的保留时间及定性离子对参数

2.3 线性范围、检出限和定量限

采用甲醇-0.1%甲酸溶液将飞燕草素-3-半乳糖苷、飞燕草素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-阿拉伯糖苷、锦葵素-3-半乳糖苷、芍药素-3-半乳糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷、芍药素-3-芸香糖苷、牵牛花素-3-半乳糖苷、锦葵素-3-阿拉伯糖苷、牵牛花素-3-葡萄糖苷和矢车菊素-3-芸香糖苷11种花青苷标准品配制成质量浓度分别为0、10、30、50、100μg/L的混合标准溶液，利用优化好的液相色谱和质谱条件依次进行测定。以峰面积对质量浓度绘制标准曲线，如表2所示，11种化合物的线性相关系数（r）为0.9950～0.9996，表明各化合物在0～100μg/L范围内线性关系良好，本方法能够满足检测需求。取被多次提取花青苷后的样品残渣作为空白基质，采用在空白基质中添加目标化合物的方法，以3倍信噪比确定检出限，以10倍信噪比计算定量限，结果见表2。

表2 11种花青苷的线性方程、相关系数、检出限和定量限

2.4 不同蓝莓品种的花青苷种类和含量分析

采用本试验建立的方法对高灌蓝莓品种‘蓝丰’和‘喜来’以及兔眼蓝莓品种‘蓝冠’的花青苷类物质进行定性和定量检测，从‘喜来’和‘蓝冠’中分别检测出11种花青苷类物质，从‘蓝丰’中检测出10种花青苷类物质（表3）。不同品种间各花青苷类物质的含量存在明显差异。‘蓝丰’的总花青苷含量为3 460.8 mg/kg，其中锦葵素-3-阿拉伯糖苷含量最高，其次是飞燕草素-3-葡萄糖苷；‘喜来’的总花青苷含量为3 194.6 mg/kg，其中含量最高的是飞燕草素-3-葡萄糖苷，其次是锦葵素-3-半乳糖苷；‘蓝冠’的总花青苷含量为4 866.6 mg/kg，其中含量最高的是矢车菊素-3-葡萄糖苷，其次是锦葵素-3-阿拉伯糖苷。

表3 不同蓝莓品种的花青苷种类及含量

3 结论

本研究以‘蓝丰’‘喜来’和‘蓝冠’为试材，建立了利用超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱技术对蓝莓中花青苷类物质进行定性和定量分析的方法。该方法快速、准确，在0～100μg/L范围内线性关系良好，r值为0.9950～0.9996，能够满足检测需求。利用该方法分别从‘喜来’和‘蓝冠’中鉴定出11种花青苷，从‘蓝丰’中鉴定出10种花青苷，且3个品种间各种花青苷类物质含量存在明显差异，主要花青苷类物质种类和含量也存在一定差异——‘蓝丰’中以锦葵素-3-阿拉伯糖苷和飞燕草素-3-葡萄糖苷含量较高，‘喜来’中以飞燕草素-3-葡萄糖苷和锦葵素-3-半乳糖苷含量较高，‘蓝冠’中则以矢车菊素-3-葡萄糖苷和锦葵素-3-阿拉伯糖苷含量较高。本研究结果可为蓝莓优异种质挖掘及富含花青苷的新品种选育提供理论依据。