我国健康猪源大肠杆菌对四环素类药物耐药性的Meta分析

周玲，犹银俊，龚才伟，吕世明*，谭艾娟，郑汝青，王剑，廖书丹

(1.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025；2.黔南州养殖业发展中心动物疫病预防控制站，贵州 黔南 558000；3.贵州大学生命科学学院,贵州 贵阳 550025)

大肠杆菌(Escherichiacoli)是人和动物肠道内的共生菌及机会致病菌[1]。该菌与多种药物及多种细菌接触可形成或获得耐药性，再与其他细菌接触时可将耐药遗传因子转移出去，是潜在的耐药基因储存库，因此这些与健康动物共生的大肠杆菌被认为是耐药性的指示菌[2]。

四环素类抗生素(tetracyclines)因价格低廉且毒性较低的优点广泛应用于养殖业，经查阅2000年至2020年的大量文献，从我国养殖场动物中分离鉴定的大肠杆菌已对四环素类药物产生耐药性，但在时间、地区上零散不系统。Meta分析是指采用统计方法，将多个独立的的小型研究采用严格、系统的方法进行评价、分析和合成[3]，可以避免单个小样本临床试验的局限性，使结果更全面和可靠。故本研究期望通过Meta分析方法对健康猪源大肠杆菌四环素类药物耐药状况进行系统评价，并探讨耐药性与时间、空间分布的关系。

1 材料与方法

1.1 搜索和选择标准

检索PubMed、EMBASE、EBSCO、Web of science、MD Consult(ClinicalKey)、中国生物医学文献数据库(SinoMed)、中国国家知识基础设施(CNKI)、万方(中国)数据库、维普数据库、谷歌学术共10个数据库，确定2000年1月1日至2020年1月13日发布的中国猪源大肠杆菌耐药性的研究文献。以猪源大肠杆菌及抗菌药物耐药性作为相关检索词。检索词：大肠杆菌、耐药性、药物、动物。这些术语与文本搜索相结合，包括：大肠杆菌、抗菌药物耐药性、多重耐药性、四环素类和猪。在英文文献中，检索词需要添加“中国”，因为英文文献中会报道其他国家。

1.2 纳入和排除标准

1.2.1 纳入标准

文献纳入标准如下：可以获得大肠杆菌四环素耐药率的文献；可获得大肠杆菌菌株总数(或可用于计算它们的数据)的文献；发表日期为2000年1月1日至2020年1月13日的文献；原始研究文献；关于动物的报告。

1.2.2 排除标准

文献排除标准如下：菌株不是来自健康动物，而是来自患病动物或病料的文献；没有使用标准方法检测耐药性、没有报告样本量或数据不适当的文献；在耐药性检测前，大肠杆菌菌株通过其他标准预先选择，如含有某些基因等文献；大肠杆菌菌株数少于3株的文献；市场猪肉来源、猪场环境来源的文献；重复数据的文献；不是来自猪，来自于其他动物的文献；日期范围之外的文献；综述及统计分析的文献。

1.3 文献信息摘录

阅读从数据库中检索出来文献的题目、摘要，根据纳入条件进行文献初步筛选；然后通过阅读全文，根据排除标准进行第二次筛选。用Excel表摘录下第一作者、发表时间、样本量、耐药菌株数、研究地区、耐药率、试验方法、评判标准等关键信息。

1.4 文献质量评价

根据Ali等[4]的研究，以及Joanna Briggs Institute推荐的批判性评估检查表[5]进行研究质量评估。检查表由7个问题组成，每题回答“是”得1分，问题4有2分。每项研究的最终分数在0到8之间。

1.5 统计分析

使用Microsoft Excel软件进行数据收集及基础计算，使用Revman 5.3软件在该荟萃分析中进行合并，参照陈月红等[6]的方法进行最终结果转换，效应值、95%置信区间上限与下限的转换值即是最终所需要的耐药率合并值及其95%置信区间。公式为：效应量的转换值=效应量/(1+效应量)；95%置信区间下限的转换值=95%置信区间下限值/(1+95%置信区间下限值)；95%置信区间上限转换值=95%置信区间上限值/(1+上限值95%置信区间)。基于显著异质性的可能性，使用卡方检验来估计研究之间的异质性，若P>0.10，则认为没有异质性，采用固定效应模型(F)；若P<0.10，则认为研究间具有异质性，采用随机效应模型(R)。0%

2 结果

2.1 文献筛选流程及结果

用计算机检索了10个电子数据库，结果见图1。

图1 文献检索及筛选流程

由图1可见，检索PubMed 7篇、EMBASE 3篇、EBSCO 24篇、Web of Science 149篇、MD Consult(ClinicalKey)14篇、中国生物医学文献数据库(SinoMed)141篇、中国国家知识基础设施(CNKI)40篇、万方(中国)数据库281篇、维普数据库4篇、Coogle Scholar 5篇，共确定了从2000至2020发表的668篇文献。在对标题和摘要进行初步评价后，排除了547篇不相关和重复的文章，其余121篇文章进行全文浏览。121篇文献在浏览后，有101篇被排除在外，具体原因有：34篇样本来自患病动物，32篇没有使用标准方法检测耐药性、没有报告样本量或数据不恰当的研究，16篇信息不完整的研究，9篇市场猪肉来源或环境样本来源，4篇文献使用重复数据，3篇文献菌株已经通过筛选，1篇不在时间范围以内，1篇来自其他动物，1篇不是原始研究。经筛选后，最后纳入20篇文献进行Meta分析。

2.2 纳入研究的基本特征和偏倚风险评价

对经筛选后纳入的20篇研究基本情况及质量进行评价，评价得分，见表1。

表1 纳入文献基本情况及质量评分

2.3 Meta分析

2.3.1 健康猪源大肠杆菌四环素类药物耐药率

对20篇文献分不同抗菌药物进行耐药率的合并，由于异质性较大(I2>50%)，均采用随机效应模型。在四环素耐药率的分析上，对异质性影响较大的研究进行单个逐步剔除，并仔细阅读原文发现，3篇研究[11,13,23]均是来自散养模式喂养的猪群，其耐药率明显低于集中饲养的规模化养猪场，对异质性有较大影响。而1篇研究[26]原文显示采集样本为2014至2016年，发表时间为2018年；在纳入文献质量评价中为最低分4分；与同组类其他文献存在较大异质性，此处不予合并。猪源大肠杆菌四环素类药物的耐药数据进行分别合并分析后，经过用文献[6]的方法进行转换，最终转化后的结果见表2显示。耐药率由高到低依次是：土霉素97.0%(95%置信区间为90.8%～99.1%,P<0.01)、金霉素94.7%(95%置信区间为91.9%～97.5%,P<0.01)、四环素93.5%(95%置信区间为90.8%～95.3%,P<0.01)、强力霉素74.4%(95%置信区间为58.5%～85.7%,P<0.01)、地美环素70.6%(95%置信区间为63.1%～77.2%)、替加环素34.2%(95%置信区间为31.0%～37.5%)、米诺环素33.2%(95%置信区间为3.9%～62.4%,P=0.03)。

表2 健康猪源大肠杆菌四环素类药物的耐药情况

2.3.2 健康猪源大肠杆菌四环素耐药率的亚组分析

对符合条件的17项有关大肠杆菌对四环素耐药的研究共3 796株菌株做亚组分析，分别形成不同地区、不同省份、不同时间段的亚组分析，结果如表3所示。在四环素耐药的亚组分析上，对包含4个以上的研究存在异质性，则寻找异质性来源，进行敏感性分析发现，在四环素耐药率的亚组分析上，从地理分区来看，除未收集到数据的西北外，耐药率从高到低依次是华北99.3%(95%置信区间为95.0%～99.9%)、华中95.1%(95%置信区间为82.5%～98.8%)、华北与华中94.1%(95%置信区间为86.6%～97.6%)、华东92.8%(95%置信区间为90.2%～94.8%)、华南88.6%(95%置信区间为71.8%～96.0%)、西南88.4%(95%置信区间为31.0%～99.2%)、东北87.3%(95%置信区间为81.8%～91.3%)，耐药率均高于80%，而华北耐药率最高达99.3%；从不同省份来看，除西藏自治区耐药率低于50%，为40.5%(95%置信区间为32.4%～49.0%)；其余上海市、广东省、山东省、贵州省、福建省、江苏省、北京市、吉林省、河南省、北京市与湖北省组共10省的耐药率均超过80%，北京市耐药率最高，为99.3%(95%置信区间为95.0%～99.9%)；从时间段来看，2005至2010、2011至2015、2016至2020分别为94.5%(95%置信区间为88.9%～97.4%)、92.3%(95%置信区间为89.4%～94.5%)、96.3%(95%置信区间为93.0%～98.1%)。

表3 健康猪源大肠杆菌四环素药物耐药率的亚组分析表

2.3.3 健康猪源大肠杆菌强力霉素耐药率亚组分析

对符合条件的9项有关大肠杆菌对强力霉素耐药的研究共2 696株菌株做亚组分析，分别形成不同地区、不同省份、不同时间段的亚组分析，结果如表4所示。在强力霉素耐药率的亚组分析上，从地理分区来看，除未收集到数据的西北、东北外，耐药率从高到低依次是华北98.4%(95%置信区间为24.0%～100%)、华中78.1%(95%置信区间为63.0%～88.2%)、西南76.6%(95%置信区间为54.5%～90.0%)、华南68.3%(95%置信区间为55.8%～78.5%)、华东61.1%(95%置信区间为29.0%～85.9%)，耐药率均高于50%，而华北耐药率最高达98.4%。从不同省份来看，贵州省、福建省、上海市、河北省、广东省、河南省、四川省7省的耐药率均超过50%；河北省耐药率最高，都为100.0%(95%置信区间为83.0%～100.0%)；广东省、上海市耐药率较低，分别为68.3%(95%置信区间为55.8%～78.5%)、59.3%(95%置信区间为10.7%～94.6%)。从时间段来看，2011至2015与2016至2020分别为74.4%(95%置信区间为51.0%～89.0%)、75.7%(95%置信区间为47.6%～91.4%)。

表4 健康猪源大肠杆菌强力霉素耐药率的亚组分析表

2.3.4 漏斗图

漏斗图是一种以视觉观察来识别是否存在发表偏倚的方法。小样本所得的离散度较大，常处于漏斗图的底部；大样本离散度较小，处于顶部。健康猪源大肠杆菌对四环素耐药率漏斗图基本对称(图2)，显示样本量较大且偏倚较小。

图2 健康猪源大肠杆菌对四环素耐药率的漏斗图

3 讨论

我国畜牧业生产中使用抗菌药始于20世纪70年代，并且于2017年开始施行“减抗”计划，2020年成为我国饲料全面强制性禁抗的起点。健康动物体内共生性大肠杆菌作为耐药指示菌和耐药基因储存库，对其进行耐药性监测尤为重要。有研究表明，来源于患病动物的大肠杆菌耐药性高于健康动物[27-29]。

本研究对健康猪源大肠杆菌抗四环素类药物耐药率的Meta分析发现：四环素类药物耐药率从高到低依次是：土霉素、金霉素、四环素、强力霉素、地美环素、替加环素。替加霉素耐药水平最低，为34.2%。从相关机制分析，细菌在体外时对四环素的耐药性产生较慢,但体内同种之间会呈交叉耐药[30]，以致耐药现象严重。何涛等[31]研究新型变异体tet(X)可介导一二代四环素类药物耐药；孙坚等[32]研究tet(X4)基因转入大肠杆菌能显著增强其对所有四环素的耐药性。同时，由于耐药基因能通过质粒传播[33]，有很高的可移动性，所以在较强的药物选择压力下可能促进耐药性在食物链及环境中传播，造成耐药严重。因此，养殖业应少用四环素类药物，可使用抗生素替代品。亚组分析结果显示，我国健康猪源大肠杆菌四环素、强力霉素耐药率在各地区、各省份存在差异性，耐药状况严重；在不同时间段中，随时间的推移耐药率没有明显下降。本研究存在一定局限性，因没有获得足够数量的不同年份的四环素类药物耐药率的研究，故无法详细跟踪了解四环素类药物耐药率随年限的变化。

本研究异质性较大与以下因素有关：第一，受研究分析因子的设定影响，如不同研究所选用的猪场、抽样方法及样本量不同均对猪源大肠杆菌四环素类药物合并耐药率的结果造成影响。还有各原始文献为单个组别的率，属观察性研究，不能实现随机化，稳定性不同于两个组的研究，更容易受到偏倚风险的影响，所以在合并时统计学异质性一般会比较大，国内发表的很多关于单个率的Meta分析也可证实这一点[34]。第二，受不同地区猪场的数量、规模、分布等差异的影响。华中、华南和东北地区养殖规模大，其药物使用量也大，导致该区域对四环素、强力霉素的耐药率较高。第三，与使用时间长短有关，上世纪70年代常用的饲料添加剂就包括土霉素，四环素、金霉素等，因此，大肠杆菌对这些抗生素显示了较高的耐药性，应用较晚的替加环素及不常使用的米诺环素在养殖场并没有很高的耐药水平，药物的使用时间差异也会影响研究结果。第四，与饲养模式有关，如孙理云等[24]的研究，在异质性分析中发现，对于散养模式的猪群，其耐药率明显低于集中规模化饲养的猪群。本研究还存在许多不足：研究是单组变量的Meta分析；缺乏对照设计；养殖场饲养模式等因子未纳入研究；某些亚组分析包含的文献数量较少，纳入的文献调查地区来源部分地区，这些对结果都可能存在一定影响。