高浓度葡萄糖对猪卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育的影响

张童桐，司莉南，许红霞，程文秀，陶瑞鑫，李娟

(南京农业大学动物科技学院，江苏 南京 210095)

质量优良的卵母细胞是体外受精(IVF)、体细胞核移植(SCNT)以及胞浆内单精子显微注射(ICSI)等生物技术的前提[1]。影响猪卵母细胞成熟的因素有很多，比如体外成熟环境、体外成熟液成分、卵母细胞与卵丘细胞间的互作及自身的新陈代谢。哺乳动物进入发情周期后，卵母细胞恢复减数分裂并在排卵前经过促卵泡激素(FSH)、促黄体生成素(LH)等激素协同作用完成成熟过程[2]。卵母细胞成熟包括细胞核和细胞质成熟，只有细胞核和细胞质都成熟的卵母细胞才具备受精和胚胎发育的能力[3-4]。细胞核成熟是卵母细胞从第一次减数分裂前期的双线期的停滞状态恢复并完成第一次减数分裂，排出第一极体的过程。细胞质成熟则是卵母细胞完成mRNA和蛋白质的积累，细胞骨架和细胞器的重组以及细胞代谢的改变，为卵母细胞以后的发育奠定基础[5-6]。

卵母细胞的外部环境对卵母细胞的成熟及随后的胚胎发育都会产生影响[7]。其中能量代谢对于卵母细胞的成熟是至关重要的，而葡萄糖是卵母细胞的关键代谢产物。因此葡萄糖浓度对卵母细胞成熟，减数分裂的恢复，卵丘细胞的成熟，细胞核和细胞质成熟都十分重要[7]。葡萄糖代谢异常会导致卵母细胞成熟和发育能力降低[7]。在卵母细胞成熟期间，卵泡液中的葡萄糖浓度与血浆中葡萄糖浓度水平相当[8-9]，并且葡萄糖浓度与卵巢卵泡大小存在一定正相关[10]。与代谢物不断输入的卵泡环境相比，静态体外成熟(IVM)系统要求培养基含有一定超生理浓度的葡萄糖，以避免消耗至对卵母细胞发育有害的水平。例如，通常用于IVM的TCM-199含有5.6 mmol/L葡萄糖。在IVM培养基中提供足够浓度的葡萄糖可改善卵母细胞的核成熟和发育能力[11-12]。但是，葡萄糖浓度过低(小于2.3 mmol/L)或过高(大于10 mmol/L)对卵母细胞发育有害。针对糖尿病患者及动物模型的研究揭示，糖代谢异常可引起卵母细胞核成熟异常，减数分裂过早恢复[13]，且会导致胚胎发育延迟，胚胎发育潜能降低，胚胎退化和碎片化的发生率增加[14]。在低葡萄糖浓度环境中，卵母细胞糖酵解能力的扰动表现为通过磷酸戊糖途径(PPP)和己糖糖二磷酸途径(EMP)的葡萄糖通量下降，从而限制了核酸合成和能量产生的底物[15]。而高浓度葡萄糖的体外成熟环境会导致牛卵母细胞氧化应激，发育潜能降低[16]。

随着人类生活水平的提高，糖尿病患者急剧增加，研究人员常用猪作为可能的异种器官移植来源。因此，探索高浓度葡萄糖对猪卵母细胞的影响，有助于对人类糖尿病的研究。虽然葡萄糖是卵母细胞成熟必需的能量来源之一[17]，但在猪卵母细胞的体外成熟过程中针对高浓度葡萄糖的研究却较少，故本试验将针对这一问题做了初步研究。

1 材料与方法

1.1 主要药品试剂

生理盐水、抗生素购自南京市的药店；TCM-199培养基、矿物油、牛血清蛋白(BSA)、透明质酸酶(Hya)、杜氏磷酸盐缓冲液(PBS)、澳洲胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；GSH和GSSG检测试剂盒、MDA检测试剂盒购自碧云天；葡萄糖购自Sigma公司。

1.2 卵母细胞采集与挑选

屠宰场母猪选择初情期前，未配种的大白母猪。在屠宰中取下母猪内脏之后，迅速将卵巢剪下用加有硫酸庆大霉素的生理盐水进行清洗，并防止污染产生。采集卵巢时须佩戴无菌乳胶手套，同时保持腹腔脏器干净清洁。将采集到的卵巢置于38.5 ℃、含双抗(青霉素、链霉素)200 IU/mL(如无特殊标注，双抗均为此浓度)的0.9% NaCl生理盐水中，用不锈钢保温桶(瓶口直径约7 cm，容积大约1.2 L)无菌运回实验室。通常在2 h以内运回为最佳时间，由于运输距离较远，本实验室采用大巴车托运的方式，在3 h内运回实验室。

卵巢无菌送达实验室后，用预热含双抗的生理盐水洗去卵巢表面血迹和杂质，放入37 ℃水浴锅中，保温待用。采用抽吸法对卵母细胞进行采集。注射器抽取卵泡大小为2～6 mm的卵泡液，于38.5 ℃热台上静置沉淀15 min。吸除上层卵泡液，留下沉淀，加入适量洗卵液(ASP)(TCM-199中加0.8 mmol/LL-谷氨酰胺，2% FBS)稀释沉淀，分装于60 mm培养皿中。在体视显微镜下，挑选出质量良好的具有3层及以上卵丘细胞的卵丘卵母细胞复合体(COCs)，质量好的COCs卵胞质均匀呈亮灰色，卵丘细胞分布均匀紧凑，质量差的COCs颜色发暗，卵丘细胞分布不均或几乎没有。

1.3 卵母细胞体外成熟

将收集得到的COCs经IVM清洗后，随机分为3组(每组60枚)，分别移入已在CO2培养箱中平衡4 h以上的含有不同浓度葡萄糖的IVM中(每孔60枚)，同时覆盖400 μL无菌石蜡油。在38.5 ℃、5% CO2及饱和湿度的条件下培养42 h。3个组分别为空白对照组(C)：IVM(TCM-199添加10% FBS、10% 猪卵泡液、0.8 mmol/LL-谷氨酰胺、0.242% 硫酸庆大霉素、15 IU/mL 孕马血清促性腺激素、15 IU/mL人绒毛膜促性腺激素)中加入正常浓度(5.6 mmol/L)的葡萄糖；高浓度葡萄糖组1(G-1)：IVM中加入葡萄糖浓度为10 mmol/L；高浓度葡萄糖组2(G-2)：IVM中加入葡萄糖浓度为15 mmol/L。

1.4 卵丘扩散统计与成熟卵母细胞挑选

培养42 h后，COCs平铺于培养皿底部，进行拍照并统计。卵丘扩散标准参照文献[18-20]，根据主观等级从“ 0”到“ +4”评估扩展程度，具体判定标准如下：“ 0”卵丘细胞无扩展；“+1”仅分离卵丘细胞的最外层；“+2”卵丘细胞进一步扩展，涉及卵丘的外半部分；“+3”卵丘细胞进一步扩展，但不包括放射冠，“+4”卵丘细胞完全扩展，包括最里面的放射冠。分别对C组、G-1组和G-2组扩散程度较好的COCs，即“+3”、“+4”的COCs进行统计。之后，将COCs置于400 μL 38.5 ℃ 预热Hya (1 mg/mL)中，移液枪经反复吹打使卵母细胞和卵丘细胞分离。挑选成功排出第一极体的、质量较好的MII期卵母细胞，并统计各组成熟效率。质量好的卵母细胞胞质呈亮灰色，胞质均匀，胞质与透明带之间有一条透亮的条带。

1.5 孤雌激活与胚胎体外培养

挑选的MII期卵母细胞在F+激活液(0.3 mol/L甘露醇，0.1 mmol/L MgSO4，0.05 mmol/L CaCl2，0.01%聚乙烯醇)的液滴中平衡30 s，待其沉入液滴底部。每次取5枚平衡好的卵母细胞，放入已添加F+激活液的激活槽中(BTX model 450，电极间距为0.5 cm)，单直流脉冲(0.86 kV/cm,80 μs)激活。电激活后，在孤雌激活液(PCC，胚胎体外培养液PZM3中添加细胞松弛素B 5 mg/mL)和放线菌酮(CX，1 mg/mL)化学激活4 h。随后，将卵母细胞用PZM-3中清洗3次，移入已于CO2培养箱中平衡了4 h以上的PZM-3中继续培养，培养箱的培养条件为38.5 ℃、5% CO2及饱和湿度。分别统计各组2-细胞、4-细胞和囊胚的发育效率。

1.6 卵母细胞线粒体、ROS荧光染色和胚胎囊胚核荧光染色

1.6.1 卵母细胞线粒体荧光染色

挑选MII期卵母细胞，用PBS液清洗3次；各组每次取15枚卵母细胞，于38.5 ℃培养箱中使用Mito-Tracker(10 μg/mL)活染15 min；PBS清洗3次，每次5 min；多聚甲醛(PFA)中室温固定30 min；Hoechst 33342(10 μg/mL)室温避光染核10 min，再次PBS1清洗3次，每次5 min；在载玻片上滴加一滴甘油，将胚胎放入，在盖玻片四角涂抹羊毛脂，置于甘油正上方进行压片，压至胚胎略微扁平，制片完成后，用蔡司LSM700共聚焦显微镜拍照。

1.6.2 卵母细胞活性氧(ROS)荧光染色

挑选MII期卵母细胞，用PBS清洗3次；各组每次取15枚卵母细胞，置于38.5 ℃培养箱中，使用ROS(10 μg/mL)活染30 min；PB1清洗3次，每次5 min；然后直接在荧光显微镜下观察拍照。

1.6.3 囊胚细胞核荧光染色

于168 h收集囊胚,进行Hoechst染色。细胞核染色及观察方法同上。

1.7 卵母细胞GSH和MDA含量测定

1.7.1 GSH含量测定

各组收集MII期卵母细胞30枚，PBS清洗后，加入10 μL蛋白试剂去除M溶液，使用液氮和37 ℃水浴锅进行3次快速冻融，4 ℃放置或冰浴放置5 min。4 ℃高速离心机10 000g离心10 min，取上清暂放-80 ℃冷冻保存，连续收集3次样品进行测定。按照GSH和GSSG检测试剂盒操作说明将样品、标准品和试剂加入96孔板，使用酶标仪在412 nm处测定吸光度，根据标准曲线计算GSH含量。

1.7.2 MDA含量测定

各组收集MII期卵母细胞30枚，PBS清洗后，10 μL细胞裂解液(P0013)裂解，裂解后12 000g离心10 min，取上清暂放-80 ℃冷冻保存，连续收集3次样品进行测定。按照MDA检测试剂盒操作说明配制好检测反应体系，将检测反应体系工作液按200 μL体系加入到96孔板中，随后使用酶标仪在532 nm测定吸光度。按照标准品吸光度制作标准曲线，计算获得MDA的含量。

1.8 数据统计与分析

用SPSS 20.0软件one-way ANOVA法进行方差分析和显著性检验。每组至少重复3次，数据用“平均值±标准差”表示。P<0.05，差异显著；P<0.01，差异极显著。

2 结果

2.1 高浓度葡萄糖对卵丘细胞扩散的影响

卵丘细胞扩散是卵母细胞成熟的标志之一。COCs体外成熟42 h后，C组的卵丘细胞扩散效果较好(图1 A)，而高浓度葡萄糖组的卵丘细胞扩散效果极差(图1 B、图1 C)。高浓度葡萄糖组的COCs卵丘扩散为3-级、4-级的数量，极显著低于C组的数量(图1 D)。说明高浓度葡萄糖抑制了卵丘细胞的扩散。

A.空白对照组(C)COCs；B.高浓度葡萄糖组1(G-1)COCs；C.高浓度葡萄糖组2(G-2)COCs；D COCs卵丘扩散为3-级、4-级的数量统计；**表示差异极显著(P<0.01)。下同图1 高浓度葡萄糖对卵丘细胞扩散的影响

2.2 高浓度葡萄糖对卵母细胞成熟的影响

如表1所示，卵母细胞体外成熟42 h后，高浓度葡萄糖(G-1、G-2)组的死亡率和成活率，与空白对照组(C组)相比均无显著差异(P>0.05)。此外，与C组相比，G-1组第一极体率显著下降(P<0.05)，G-2组极体率极显著下降(P<0.01)。结果表明，高浓度葡萄糖降低了第一极体的排出率，并且随着浓度的升高，第一极体的排出率会逐渐降低，但对于卵母细胞的成活没有显著影响。

表1 高浓度葡萄糖对卵母细胞体外成熟的影响

2.3 高浓度葡萄糖对MII期卵母细胞线粒体分布的影响

经高浓度葡萄糖处理过后，MII期卵母细胞线粒体分布如图2所示。在C组中，线粒体均匀分散在胞质中，而在G-1、G-2组中，线粒体出现了分布不均的情况。

图2 高浓度葡萄糖对卵母细胞线粒体分布的影响

2.4 高浓度葡萄糖对MII期卵母细胞ROS的影响

G-1、G-2中高浓度葡萄糖体外成熟环境下的卵母细胞ROS水平明显升高(图3 A、图3B和图3C)。荧光强度进一步分析发现，G-1、G-2的ROS水平极显著高于C组(图3 D，P<0.01)。

A.空白对照组(C)；B.高浓度葡萄糖组1(G-1)；C.高浓度葡萄糖组2(G-2)；D.卵母细胞ROS荧光强度统计图3 高浓度葡萄糖对卵母细胞ROS水平的影响

2.5 高浓度葡萄糖对MII期卵母细胞GSH和MDA含量的影响

与C组相比，G-1组GSH含量显著降低(P<0.05)，G-2组GSH含量极显著降低(P<0.01)，见图4 A。G-1组MDA含量与C组相比，无统计学差异(P>0.05)，但有一定的升高趋势；G-2组MDA含量比C组显著升高(P<0.05)，见图5 B。

A.GSH含量统计；B.MDA含量统计；*表示差异显著(P<0.05)图4 高浓度葡萄糖对卵母细胞GSH和MDA含量的影响

2.6 高浓度葡萄糖对孤雌胚胎发育的影响

如表2所示，G-1、G-2组比C组胚胎的2-细胞率显著降低(P<0.05)，4-细胞率呈极显著降低(P<0.01)，囊胚率也呈极显著降低(P<0.01)。表明高浓度葡萄糖对卵母细胞存在一定的毒害作用，并且会持续到胚胎发育阶段。

表2 高浓度葡萄对卵母细胞孤雌胚胎发育的影响

如图5所示，G-1、G-2组的卵母细胞发育形成的囊胚，与C组的卵母细胞发育形成的囊胚相比，在细胞数量上没有显著差异(P>0.05)。表明高葡萄糖浓度环境下的体外成熟虽然会降低胚胎的发育率，但是对已形成囊胚的发育没有显著的影响。

A.空白对照组(C)囊胚；B.高浓度葡萄糖组1(G-1)囊胚；C.高浓度葡萄糖组2(G-2)囊胚；D.囊胚细胞数统计图5 葡萄糖浓度对卵母细胞孤雌囊胚细胞数的影响

3 讨论

试验结果表明，高浓度葡萄糖的体外成熟环境会影响卵母细胞成熟，对卵丘细胞的扩散也有明显地不利影响。它不仅引起卵母细胞内线粒体分布发生变化及ROS水平升高，导致了第一极体的排出减少，而且降低了胚胎的发育能力。

在卵母细胞成熟过程中，卵丘细胞扩散是卵母细胞成熟的关键过程，卵丘细胞通过缝隙连接对卵母细胞进行营养输送与废物代谢，同时卵母细胞也会通过释放生长因子促进卵丘细胞的生长，卵丘细胞和卵母细胞通过这种互作，来促进卵母细胞的成熟[21]。COCs的缝隙连接是由缝隙连接蛋白组成的一种跨膜结构[22]，而I型糖尿病小鼠中，缝隙连接蛋白的表达降低，缝隙连接受损，不仅导致卵母细胞的成熟受到抑制，并且影响卵丘细胞的生长分化[21]。在猪COCs的成熟中，卵丘细胞的扩散异常会导致卵母细胞的成熟和发育能力降低[23]。本试验结果也表明，在高葡萄糖浓度环境下，COCs体外成熟后，卵丘细胞扩散受阻，说明高葡萄糖浓度的成熟环境可能影响了卵丘细胞与卵母细胞之间的正常交流，从而抑制了卵母细胞的正常成熟。

卵母细胞的质量将会影响早期胚胎的存活，怀孕的建立和维持，胎儿的发育，甚至成年疾病[24]。猪体外成熟卵母细胞的细胞核成熟和细胞质成熟极易不同步[25]，造成卵母细胞质量下降。卵母细胞在细胞核和细胞质的成熟过程中，对葡萄糖浓度具有一定的依赖性，而且葡萄糖浓度对减数分裂的恢复和第一极体的排出有着重要的作用[26-27]。COCs的葡萄糖代谢主要是通过卵丘细胞进行的，卵丘细胞代谢后产生丙酮酸可被卵母细胞直接利用，COCs的缝隙连接受损后，丙酮酸向卵母细胞的输送受阻，同时导致线粒体的分布不均，引起供能不足，从而影响卵母细胞成熟[7]。高葡萄糖浓度环境下会导致葡萄糖代谢的改变，通过葡萄糖代谢途径磷酸戊糖途径(PPP)，对卵母细胞的减数分裂的恢复产生影响，PPP途径代谢增强，导致减数分裂的过早恢复，卵母细胞无法正常成熟，第一极体排出减少；同时糖酵解活性改变，会导致活性氧的增加，造成卵母细胞损伤[14,16,28]。ROS、MDA水平的增加，表明卵母细胞本身产生了氧化应激，同时抗氧化物GSH的水平显著降低，容易导致原本的平衡状态被打破，一旦超过其本身的处理能力，会导致卵母细胞的损伤，并且会引起细胞凋亡。进而损害人和牛卵母细胞发育能力[16,29]，高葡萄糖浓度环境会使己糖胺生物合成途径通量增加，使细胞分裂和囊胚形成形成能力下降[30]。由于非洲猪瘟影响，卵巢的采集难度增加，采集时间增长，实验室平均成熟效率与胚胎发育效率有所下降。因此，本试验C组的成熟效率与孤雌胚胎的发育效率，比章美玲等[31]报道的结果低。虽然在高葡萄糖浓度成熟环境下，卵母细胞形成的囊胚细胞数与正常成熟环境下没有显著差异，但是其可能会在胚胎植入后产生不良影响，在小鼠中发现，胚胎植入后停止发育的概率增加[32]。本试验进一步验证，高葡萄糖浓度体外成熟环境，也会对猪卵及其胚胎发育能力造成损伤。