卵巢microRNA的调控作用

成 磊，刘凌斌，李佳璐，任灵通，赵永聚 (西南大学 动物科技学院 重庆市牧草与草食家畜重点实验室/重庆市草食动物资源保护与利用工程技术研究中心，重庆 400715)

卵巢作为雌性动物生殖器官，在发育过程中会自发产生一些生理过程，如：卵泡发育、排卵、黄体形成与退化等，其中卵泡发育作为动态发育过程，从原始卵泡到成熟卵泡主要经历了征集、选择、优势化和闭锁几个重要环节。而在卵泡发育的成熟过程中，颗粒细胞作为一种支持卵泡形成和发育的重要细胞，当细胞发生凋亡时，可诱发卵泡闭锁和退化[1]，且颗粒细胞分泌产生的雌激素对动物的生理机能具有重要调节作用。除此之外，颗粒细胞与卵母细胞和卵泡内膜细胞之间的相互作用对于卵巢的发育十分重要[2]。

miRNA作为现阶段研究最为广泛的一类内源性非编码RNA，其最早发现于线虫体内，发现miRNA-lin4可与lin4基因的3′UTR互补结合，抑制lin4基因的翻译来行使miRNA功能，进而在线虫的发育过程中发挥作用[3]。研究表明，在卵巢发育过程中被鉴定的大多数miRNA来源于组织细胞，且在卵泡发育[4-5]、黄体形成与退化[6]、颗粒细胞增殖与凋亡[7-8]以及性腺类固醇激素合成[9]等过程中发挥重要作用。现主要对卵泡发育、黄体形成与退化、卵母细胞成熟、颗粒细胞增殖与凋亡以及性腺类固醇激素合成过程中的相关miRNA以及作用机制进行综述，以期为发现及鉴定更多与卵巢发育相关的miRNA及深入探索卵巢发育的调控网络提供理论基础。

1 miRNA对卵巢的调控作用

1.1 卵巢和卵巢特定组织miRNA表达谱的鉴定研究表明，miRNA是卵巢中最丰富的小RNA分子，在卵巢发育过程中发挥着重要作用，所以挖掘鉴定与卵巢发育相关的miRNA是研究miRNA调控卵巢发育的前提。随着高通量测序技术的快速发展和成本的降低，许多卵巢及卵巢特定组织的miRNA表达谱已相继被鉴定(表1)，包括鼠[10]、鹅[11]、牛[12-15]、鸡[16-17]、人[18-19]、猪[20]、山羊[21]、绵羊[22-23]等物种，这些不同物种中miRNA的发现将有助于对不同发育阶段的卵巢及卵巢特定组织中miRNA功能的研究。AHN等[10]通过Illumina测序方法，在小鼠卵巢组织中鉴定出398个已知miRNAs和30个新型miRNAs，其中Let-7、let-7i、miR-672、miR-322、miR-503和miR-465家族是X染色体上检测到的最丰富的X-连锁miRNA，而miR-672、miR-503和miR-465家族在睾丸与卵巢组织中优先表达。XU等[16]就巢鹅卵巢中miRNAs进行表达谱分析，共鉴定出1 328个保守miRNAs和22个新型miRNAs，并对差异表达的miRNAs(miR-320、miR-202、miR-146和miR-143*)进行通路富集分析，发现这些miRNAs主要参与性腺类固醇激素生物合成。XIONG等[12]在牦牛生发泡期(GV)和中期Ⅱ(MⅡ)的卵母细胞中鉴定出801和1 018个特异组织表达的miRNAs，共发现75个miRNAs差异表达；其中MⅡ期相较于GV期，47个miRNAs表达上调，28个miRNAs表达下调，通过通路富集分析发现，这些miRNAs主要参与ECM(细胞外基质)—受体相互作用途径和蛋白质消化吸收途径。WU等[16]采用高通量测序技术，分析了产蛋率高和低的鸡卵巢组织中miRNAs表达谱，共发现了17个差异表达的miRNAs，其中6个是新型miRNAs，11个是已知miRNAs；通过基因富集分析发现，这些已知miRNAs主要参与类固醇激素生物合成过程；并发现在繁殖调控相关通路中miR-200a-3p的表达显著上调，表明该miRNA可能是影响家禽繁殖通路的关键调节因子，但具体的调节机制仍需进一步研究确认。

表1 卵巢或卵巢不同组织中miRNAs表达谱的鉴定

现阶段，关于不同物种卵巢的卵泡及各个卵巢功能细胞(颗粒细胞、卵丘细胞、卵母细胞等)miRNA表达谱的研究已全面展开，研究者通过qRT-PCR技术对卵巢发育相关的miRNA进行定量分析，并结合生物信息学分析软件、荧光素酶报告基因及Western blot等试验验证关键候选miRNA在卵巢、卵泡、黄体以及卵泡亚功能单位中的功能及调控机制，表明miRNA可作为调控卵巢发育的关键调控因子，其在卵巢发育过程发挥着重要作用。

1.2 miRNA对卵泡发育的调控作用卵泡发育是一个高度协调和精确调节的生理过程[24-25]，在雌性动物性机能发育的不同时期，都呈现出一种动态变化过程。目前关于miRNA调控卵泡发育的研究已取得很多成果(表2)，miRNA主要参与调控原始卵泡的形成与生长，如miR-143[26]、miR-145[27]、miR-376a[28]等。ZI等[25]首次在多产与非多产山羊的卵泡期卵巢中鉴定出191个差异表达的miRNA，发现miR-21、miR-99a和miR-493在卵泡组织中高表达，暗示其有可能在卵泡发育中起重要作用，但具体的作用机制尚不清楚。miR-143作为促凋亡、抗增殖调控因子，研究发现其在小鼠原始卵泡中通过抑制前颗粒细胞增殖和下调细胞周期相关基因的表达来抑制原始卵泡的形成[26]。YANG等[27]为研究miRNA调控原始卵泡发育分子机制，在初生后3～5日龄的小鼠卵巢中鉴定出24个差异表达miRNA，通过基因富集分析表明，这些miRNA通过影响Wnt、MAPK、TGF-β、mTOR等信号通路来调控原始卵泡生长的起始，其中TGF-β信号通路对于卵泡的发育尤为重要，它可以调控卵泡发育的各个阶段，而miR-145通过靶向TGF-β信号通路中的TGFBR2基因，调控原始卵泡发育和维持原始卵泡静止。有研究新生小鼠中调控哺乳动物原始卵泡形成的miRNA-靶mRNA，发现miR-376a可直接作用于增殖细胞核抗原基因(PCNA)的3′UTR，过表达miR-376a后可显著下调PCNA表达，且卵巢中卵母细胞的凋亡数量会显著降低，原始卵泡数量会显著增加[28]，这些研究都为研究miRNA调控卵泡生长发育提供理论基础。虽然miRNA作为关键调节因子在卵泡发育过程中起着重要调节作用，但通过哪些信号通路中的哪些关键基因影响卵泡的发育仍是研究的难点与热点，因为卵泡发育作为一个复杂的生理过程，在不同发育阶段(原始卵泡、生长卵泡、成熟卵泡)miRNA所发挥的作用不一样，要想彻底了解miRNA在卵泡发育过程中如何发挥作用还需进一步研究。

1.3 miRNA对卵泡闭锁的调控作用在卵泡发育的过程中，只有1%的卵泡会发育成熟和排卵，而99%以上的卵泡在不同发育阶段都会发生闭锁退化，将该过程称为卵泡闭锁[29]。卵泡闭锁是一种高度复杂的自发现象，是由卵母细胞周围的颗粒细胞凋亡所致[30]。近些年研究表明，miRNA通过靶向作用于不同信号通路中的关键基因来调控卵泡闭锁，进而影响颗粒细胞的凋亡(表2)[31-33]。LIN等[34]在猪正常卵泡和早期闭锁卵泡中鉴定出23个差异表达miRNAs，并发现差异表达miR-26b可通过靶向作用于DNA损伤相关基因(ATM)，进而促进颗粒细胞凋亡。CAO等[35]探索不同闭锁阶段卵泡中let-7 miRNA家族的概况，发现在健康和早期闭锁卵泡中所有let-7家族成员的表达显著下调，而let-7g在逐渐闭锁的卵泡中表达却上调，表明let-7g在颗粒细胞的凋亡中起着重要作用。虽然已确定了许多与卵泡闭锁相关的miRNA，但是这些miRNA通过哪些靶基因在不同物种中发挥相应功能还需进一步研究鉴定。

1.4 miRNA对卵母细胞成熟的调控作用卵母细胞的成熟是指卵母细胞获得恢复减数分裂以及进一步发育到第2次减数分裂，为受精及胚胎发育做准备[36]。Dicer作为影响miRNA和siRNA成熟的关键因子，可调节转录水平的基因重组与基因表达。MURCHISON等[37]对小鼠卵母细胞中的Dicer敲除后发现纺锤体的形成和染色体联发生异常，导致卵母细胞无法完成减数分裂，表明miRNA在卵母细胞发育过程中发挥重要作用。然而对于特定miRNA调控卵母细胞成熟机制的研究报道很少(表2)，尤其是miRNA对于卵母细胞成熟的调控。XIAO等[38]采用miRNA微阵列技术分析胰岛素样生长因子1(IGF-1)处理后的MⅠ期人卵母细胞中miRNA表达情况，发现145个miRNAs表达上调，200个miRNAs表达下调，而被上调超过30倍的miR-133b被选做后续研究，发现miR-133b在转录和翻译水平上负调控其潜在靶点转胶蛋白-2(TAGLN2)，影响着卵母细胞的生长和成熟。PAN等[39]发现在猪卵母细胞体外成熟阶段，抑制miR-574的表达导致卵丘细胞扩展显著增加，而透明质酸合成酶2(HAS2)作为卵丘细胞产生细胞外基质的关键酶，miR-574可直接靶向卵丘细胞中的HAS2基因抑制卵母细胞成熟。在对猪卵丘-卵母细胞复合体(COCs)中的miRNA研究中发现，miR-378在卵丘细胞MⅡ期的表达水平明显低于GV期，且miR-378能抑制卵丘细胞中芳香化酶(CYP19A1)的表达，导致雌二醇(E2)的分泌显著下降，这就表明抑制芳香化酶是miR-378调节COCs成熟的机制之一[40]。SONG等[41]对猪GV期和MⅡ卵母细胞中的miRNA进行了深度测序分析，共发现7种差异表达miRNA，进一步研究发现miR-27b-3p能够靶向作用于PPARγ基因调控卵母细胞成熟。所以，miRNA作为一种非编码RNA在卵母细胞成熟过程中扮演着重要作用，但对于miRNA调控卵母细胞成熟的机制研究还很少，尤其是对转录后水平分子机制的研究。

1.5 miRNA对黄体形成与退化的调控作用黄体是成熟卵泡排卵后，由卵泡残余组织迅速发生深度重塑、高度血管化后形成的暂时性腺体样结构[42]。研究表明，miRNA在黄体的形成与退化中过程扮演着重要作用(表2)[42-45]，目前已初步阐明miR-96[42]、miR-29b[43]以及miR-17-5P和let-7b[44]在黄体发育和维持中发挥着重要作用。OTSUKA等[44]为了研究miRNA在黄体形成与退化过程中的作用，将小鼠中的Dicer1敲除，造成小鼠黄体形成受损进而导致黄体功能不全无法维持妊娠，并通过蛋白质印迹分析发现，卵巢中let-7b和miR-17-5P表达下调，而TIMP1蛋白表达上调，为进一步解决Dicer1缺乏时TIMP1表达上调机制，作者构建双荧光素酶载体，发现let-7b和miR-17-5P通过靶向作用于TIMP1基因从而调控黄体形成。MOHAMMED等[42]通过miRNA微阵列技术对牛卵泡和黄体组织中miRNA进行分析，发现miR-183-96-18簇在黄体组织中相对于卵泡组织表达显著增加，且miR-96是该簇内上调最多的miRNA，后续在人和牛黄体细胞中研究发现，miR-96通过靶向作用于FOXO1基因促进黄体颗粒细胞分泌产生孕酮。XU等[43]对miR-29b在牛黄体发育的不同阶段中的表达水平以及调控黄体细胞增殖和孕酮的分泌量进行研究，发现miR-29b在黄体形成的早期表达最高，中期、后期时逐渐下降，退化期的表达量最低，进一步研究发现miR-29b可降低OXTR基因表达，促进孕酮的分泌和黄体细胞的增殖。同样在另一项研究中发现，miR-378可通过靶向IFNGR1基因调控黄体细胞凋亡[46]。

表2 miRNAs在卵泡和黄体发育中的作用

目前，虽已有大量研究表明miRNA在黄体形成与退化过程中发挥着重要作用，但对黄体中miRNA生物学影响的研究很少，尤其是对黄体组织的研究。所以特定miRNA在黄体形成与退化过程中介导的细胞增殖、凋亡以及孕激素分泌等分子机制还有待于深入研究。

2 miRNA对颗粒细胞的调控作用

颗粒细胞作为组成卵泡的重要成员，是产生雌激素的重要场所。目前，关于miRNA在卵泡发育中的研究主要集中在调控颗粒细胞增殖、凋亡以及性腺类固醇激素合成方面(表3)。

2.1 miRNA对颗粒细胞增殖的调控作用颗粒细胞作为卵巢组织中最易分离的细胞，也是现阶段研究最多的生殖细胞之一。研究表明，miRNA对颗粒细胞有促增殖和抗增殖作用(表3)。在抗增殖方面，miR-383可通过抑制细胞周期相关蛋白(cyclin D1、cyclin B)和细胞周期蛋白依赖激酶(CDK1、CDK2、CDK4)的表达，将颗粒细胞周期阻滞在G0/G1期，进而抑制颗粒细胞的增殖[47]。miR-34c作为抗增殖调节因子，能与靶基因FOXO3a相互作用，抑制猪颗粒细胞增殖[48]。GENG等[49]在患有多囊卵巢综合症(PCOS)患者的颗粒细胞中检测到miR-99a表达显著下调，IGF-1R表达上调，进一步研究得出miRNA-99a通过作用于IGF-1R基因，抑制颗粒细胞增殖和促进颗粒细胞凋亡。在促进颗粒细胞增殖方面，PANDE等[50]在发情周期第19天的牛优势卵泡颗粒细胞中发现高度富集miR-424/503簇，进一步研究发现miR-424/503簇通过激活蛋白信号通路靶向Smad7基因调控牛颗粒细胞增殖和细胞周期进程。而miR-17-92簇(miR-17-5p、miR-19a、miR-20a、miR-92a)通过靶向PTEN和BMPR2基因调控牛颗粒细胞的增殖和分化[51]。KONG等[52]在PCOS患者的颗粒细胞中对miR-9是否影响颗粒细胞的增殖和凋亡进行研究，发现在颗粒细胞中miR-9表达显著上调，维生素D受体(VDR)表达显著下调，进一步研究得出miR-9通过靶向VDR促进颗粒细胞增殖和抑制颗粒细胞凋亡。同样在PCOS患者的颗粒细胞中miR-93表达显著上调，并通过靶向CDKN1A基因促进颗粒细胞增殖，而且发现高浓度的胰岛素会引起miR-93表达上调、CDKN1A表达下调和促进人卵巢颗粒细胞的增殖[53]。以上在PCOS患者颗粒细胞中对miR-9、miR-93以及miRNA-99a调控颗粒细胞增殖与凋亡的研究，为研究PCOS中颗粒细胞功能障碍提供新思路。

2.2 miRNA对颗粒细胞凋亡的调控作用miRNA作为重要调控因子在颗粒细胞凋亡过程中也发挥着重要作用(表3)，可促进和抑制颗粒细胞的凋亡。在促凋亡方面，AN等[54]研究表明，增加chi-miR-4110表达可显著降低Smad2的表达，进一步研究得出chi-miR-4110通过靶向作用于Smad2基因，促进山羊颗粒细胞凋亡。CAO等[55]研究表明，在猪卵巢卵泡闭锁过程中let-7g表达水平显著上调，将let-7g模拟物转染到颗粒细胞时，发现细胞凋亡相关基因(CASP3、BAX和BIM)的表达显著上调，抗凋亡基因(BCL-2和MCL-1)则显著下调，过表达let-7g后MAP3K1表达显著降低，并导致FoxO1基因发生去磷酸化，进一步研究得出let-7g通过靶向作用于MAP3K1基因，促进颗粒细胞的凋亡，从而促进FoxO1表达和去磷酸化。同样在对let-7g的另一项研究中发现，let-7g可直接靶向TGFBR1基因，促进颗粒细胞凋亡[56]。ZHOU等[57]研究表明，miR-150通过靶向作用于STAR基因促进颗粒细胞凋亡。miR-26b通过直接作用于Smad4基因促进猪颗粒细胞凋亡，且可间接靶向去泛素化酶9X(USP9X)来调控Smad4蛋白发生去泛素化，从而促进猪颗粒细胞凋亡[58]。在抑制颗粒细胞凋亡方面，ZHU等[59]研究表明，在猪卵泡颗粒细胞中miR-222通过靶向血小板凝血酶蛋白1(THBS1)来调节雌激素的分泌，并作为抗凋亡因子来控制颗粒细胞的凋亡。XIONG等[60]研究表明，miR-22在小鼠健康卵泡中的表达量最高且能与靶基因SIRT1结合，进而抑制小鼠颗粒细胞凋亡。miR-92a作为细胞凋亡途径中的关键因子，其在猪健康卵泡中表达最高，可靶向作用于Smad7基因抑制颗粒细胞的凋亡[61]。SONG等[62]研究PCOS患者颗粒细胞中miRNA作用，发现在颗粒细胞中miR-186和miR-135a的表达水平显著升高，且两者都通过靶向雌激素受体2(ESR2)，抑制人颗粒细胞的凋亡；而且还发现在颗粒细胞中miR-186和miR-135a的表达水平与PCOS患者的血清E2水平呈正相关，这一研究也为了解PCOS病理生理学提供了新的见识。

表3 miRNA在颗粒细胞中的作用

2.3 miRNA对性腺类固醇激素合成的调控作用在卵泡发育过程中，颗粒细胞和卵泡内膜细胞会分泌性腺类固醇激素。其中雌激素可刺激卵泡发育和诱导动物发情，孕激素可通过刺激子宫内膜腺体分泌和抑制子宫肌肉收缩而促进胚胎着床并维持妊娠。而在性腺类固醇激素的合成过程中miRNA发挥着重要调节作用(表2,3)。GAO等[63]研究表明，miR-222作用于RUNX2基因参与HCG(人绒毛膜促性腺激素)诱导的RUNX2表达，且在这一过程中miR-222促进E2的生成和山羊颗粒细胞的增殖。LIU等[64]对猪颗粒细胞中差异表达miR-1275的作用进行研究，发现miR-1275可促进颗粒细胞凋亡和抑制雌激素合成。孕酮受体(PGR)作为孕酮产生生理作用的主要甾体激素，可与miR-378-3p靶向结合抑制颗粒细胞中PGR的表达影响孕酮生成[65]。miR-150通过抑制绵羊颗粒细胞中性腺类固醇激素合成相关基因(CYP11A1和HSD3B1)的表达，抑制孕酮合成[66]。miR-205作为细胞增殖与凋亡调节因子，通过靶基因环腺苷酸反应成分结合蛋白1(CREB1)作用，抑制鼠雌激素的合成与促进颗粒细胞凋亡[67]。miR-143作为卵巢颗粒细胞增殖的关键调节因子，主要在小鼠颗粒细胞中表达，并可作为FSH信号通路的介质，通过靶向KRAS基因调节E2的合成和促进颗粒细胞增殖[68]。miR-133b通过下调小鼠颗粒细胞中Foxl2基因的表达，从而抑制性腺类固醇激素相关基因(STAR和CYP19A1)合成，促进E2生成[69]。对于miRNA调控性腺类固醇激素合成方面的研究主要集中在颗粒细胞中，但到底有哪些miRNA发挥直接调控作用，哪些miRNA发挥间接作用，这仍是目前研究的重点和难点，也是未来有待解决的问题之一。

3 讨论

随着miRNA在生物学领域的研究越来越多，有关miRNA在组织以及细胞中的调控机制已成为研究热点。目前，miRNA在卵巢发育中的研究主要集中于调控卵母细胞和颗粒细胞功能上，仍处于起步阶段。近几年，越来越多与卵泡、黄体、颗粒细胞相关的miRNA通过生物信息学技术、高通量测序、miRNA微阵列等方法被挖掘鉴定，其中表达量高的miRNA与卵巢发育相关的信号通路、靶基因相互作用，形成一个复杂的、完整的卵泡发育、黄体形成与退化、颗粒细胞增殖凋亡、类固醇激素合成的调控网络，间接参与到卵巢发育的过程中。但是miRNA调控卵巢发育主要是通过对靶基因的调控实现，因此在调控网络中寻找特定miRNA的靶基因，研究其在卵泡发育、黄体形成、卵母细胞成熟、激素合成中的功能是现阶段与未来的研究重点。

特定miRNA的功能主要受到miRNA与mRNA之间复杂相互作用的影响，这些相互作用显示出多对一和一对多的关系，所以仅仅通过一个靶基因已很难全面阐述miRNA在特定组织和细胞中的生物学功能。因此，随着研究者对各组织器官miRNA调控网络研究的深入，在未来应将研究的方向放在miRNA对信号通路中多个因子的调控机制上，这更有助于揭示miRNA在特定组织中的生物学功能。另外，卵泡闭锁作为卵泡发育的重要生理过程，目前在卵泡闭锁中miRNA的筛选鉴定和作用机制研究较少，所以对于卵泡闭锁阶段miRNA的功能研究也是今后的一个研究方向。

随着转基因技术和基因敲除技术的日渐成熟，miRNA在细胞模型和特定组织的研究将更加深入，这也为miRNA调控卵巢发育的机制研究奠定了理论基础。