蒙古黄芪种子处理方式的响应面优化

刘 杰， 张雄杰， 霍秉新， 尹 春， 刘 燕， 贾长松， 盛晋华

(1.内蒙古农业大学农学院， 呼和浩特 010019；2.内蒙古天际绿洲特色生物资源研发中心， 呼和浩特 010018；3.内蒙古天衡制药有限公司， 内蒙古 巴彦淖尔 014400)

蒙古黄芪[Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var.mongholicus(Bge.) Hsiao]为豆科蝶形花亚科黄耆属多年生草本[1-2]，具有补气升阳、固表止汗、利水消肿等功效[3-4]，是内蒙古的道地药材[5]，现代药理研究发现，蒙古黄芪含有锌、铁、硒、铜等多种微量元素以及多糖类、三萜皂苷、黄酮类等多种化学成分[6-7]，具有保护心肌缺血及神经损伤、抗氧化、抗病毒等功效[8]，在中药预防新型冠状病毒肺炎方案中，黄芪是出现频次最高的中药之一[9]。目前随着蒙古黄芪市场需求的加大以及野生资源的减少，人工栽培的面积逐渐加大，但由于蒙古黄芪种子硬实性高、发芽率低，制约其规范化生产[10]。前人对提高蒙古黄芪种子发芽率的处理方式有了一定的研究，许陶瑜等[11]结果表明，全光照和全黑暗条件对蒙古黄芪种子萌发的影响均不显著；赤霉素和双氧水处理虽然也可以提高黄芪硬实种子的发芽率但效果不明显[12]；低浓度的聚乙二醇(PEG)和NaCl对蒙古黄芪种子的萌发也无促进作用[13]；而磨砂[14]、温水和75%酒精浸种[15]、98%浓硫酸浸泡[16]等处理均能有效破除蒙古黄芪种子硬实性，提高蒙古黄芪种子的发芽率，但对于磨砂时间、浸种温度、浸种时间梯度的研究较少，且研究较多的是甘肃兰州[17]、山西大同[18]、内蒙古赤峰[19]等地区的蒙古黄芪种子，对于蒙古黄芪道地产区内蒙古武川地区的种子研究较少。

本研究以内蒙古武川县的种子为材料，综合考虑成本及危险性等方面，本试验选用磨砂+温水浸种的方式，将蒙古黄芪种子发芽率作为评价指标，以磨砂时间、浸种温度、浸种时间为考察因素，采用单因素试验与响应面分析相结合的方法，优化蒙古黄芪种子的处理方式，进而提高其发芽率。

1 材料与方法

1.1 试验材料

种子取自2019年内蒙古武川县和太仆寺旗蒙古黄芪基地留种田，千粒重为(5.86±0.14)g，净度为(92.81±2.14)%。

1.2 试验设计

采用常规的培养皿发芽法，取籽粒饱满且有光泽的蒙古黄芪种子经10%次氯酸钠表面消毒后，用蒸馏水冲洗干净，磨砂(砂纸打磨)后放入温水中浸泡，并均匀排列在垫有两层滤纸的90 mm玻璃培养皿中，放置于20 ℃恒温培养箱中，发芽期间每天定时补充蒸馏水保持滤纸湿润，观察种子萌发情况并记录。

以磨砂时间5 min、浸种温度40 ℃、浸种时间5 min为基础分别设3个单因素试验，其中磨砂时间设5、10、15、20 min四个处理；浸种温度设40、50、60、70、80 ℃五个处理；浸种时间设5、10、15、20、25 min五个处理。每个处理100粒种子，重复3次。根据Box-Benhnken中心组合实验的设计原理，以磨砂时间、浸种温度、浸种时间为自变量，发芽率为响应值，并根据单因素试验的结果筛选确定因素水平，进行三因素三水平的响应面优化试验。

1.3 测定项目与方法

自吸水后，每24 h观察并记录发芽种子数量，以种子胚根突破皮≥2 mm为种子发芽，截至第7天计算发芽率。计算公式为：

发芽率(%)=(n/N)×100%，式中：n为最终正常发芽的粒数；N为供试种子总数。

1.4 数据统计与分析

数据采用WPS软件整理，用SPSS 25、Design-Exper 8.06等软件进行统计分析。

2 结果与分析

由图1可知，随着磨砂时间的增加，蒙古黄芪种子的发芽率呈先增高后降低的趋势。以磨砂时间15 min发芽率最高，达到72%，确定适宜的磨砂时间是10～20 min。

由图2可知，随着浸种温度的增加，蒙古黄芪种子的发芽率呈先增高后降低的趋势。以浸种温度60 ℃发芽率最高，达到76%，确定适宜的浸种温度是50～70 ℃。

由图3可知，随着浸种时间的增加，蒙古黄芪种子的发芽率呈先增高后降低的趋势。以浸种时间10 min发芽率最高，达到77%，确定适宜的浸种时间5～15 min。

根据单因素试验确定的因素水平(见表1)做响应面优化试验，结果见表2。对表2中数据进行响应面分析，以发芽率为响应值，通过二阶多项式进行回归，所建模型的方差分析见表3，得实际因素的回归方程为Y=-216.970 00+8.909 50 A+8.753 25 B+1.253 00 C+0.056 500 AB+0.020 000 AC+0.040 000 BC-0.453 90 A2-0.088 475 B2-0.220 90 C2。由表3可知，模型达到极显著水平(p<0.01)，模型决定系数R2=0.994 1，说明模型拟合程度好，失拟项未达到显著水平(p>0.05)，表明误差较小。其中，A、B、C、AB、A2、B2、C2均达到极显著水平(p<0.01)；BC达到显著水平(p<0.05)；AC未达到显著水平(p>0.05)。

表1 因素与水平Table 1 Settings of factors and levels

表2 Box-Benhnken试验设计方案与结果Table 2 Box-Benhnken experimental design scheme and results

表3 回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis results of regression model

根据二次多项式模型，应用Design-Exper 8.06软件绘制三维响应曲面，见图4～图6。

由图4～图6可以直观地看出各因素交互作用对蒙古黄芪种子发芽率的影响，曲线密集或陡峭程度越高则表明对结果响应值影响越大[20]。由图4可知，沿着浸种温度方向等高线比磨砂时间等高线更加密集陡峭，浸种温度对蒙古黄芪种子发芽率的影响要大于磨砂时间；由图5可知，沿着磨砂时间等高线比浸种时间等高线更加密集陡峭，磨砂时间对蒙古黄芪种子发芽率的影响要大于浸种时间；由图6可知，沿着浸种温度等高线比浸种时间等高线更加密集陡峭，浸种温度对蒙古黄芪种子发芽率的影响要大于浸种时间。由图4～图6得各因素对蒙古黄芪种子发芽率影响的大小为：浸种温度>磨砂时间>浸种时间。

由回归模型进行预测分析，发芽率的预测值为92%，最佳处理方式为磨砂时间13 min、浸种温度56 ℃、浸种时间8 min。在该处理方式下进行验证试验以检验结果的可靠性，得出蒙古黄芪种子的实际发芽率为(90.7±1.5)%，与理论预测值基本吻合，比单因素试验中的最高发芽率要高出13.7%。由此，利用响应面分析法得到的蒙古黄芪种子最佳处理方式可靠，具有实际应用价值。

3 讨 论

蒙古黄芪种子结构紧密，种脐口小，表面角质层较厚，种皮含有大量的蜡质、油脂和果胶质，导致其吸水难度加大，且又有内源抑制物的存在，使其在自然状态(即不加任何处理)下的发芽率较低[12]。因此，破除种子硬实休眠是提高蒙古黄芪种子发芽率的关键[21]。适宜的磨砂处理时间在不破坏种子内部结构的同时，可以破除种皮的角质层和硬实性[14]；适宜温度和时间的温水浸种处理在增强种皮吸水吸胀能力的同时，也能稀释发芽内源抑制物的浓度，从而提高发芽质量[17]。

单因素试验发现，随着磨砂时间的增加、浸种温度的提高、浸种时间的增加，蒙古黄芪种子的发芽率均呈先增高后降低的趋势，这与史丽萍等[15]研究结果有着相似之处。分析原因可能是：磨砂时间过长会不同程度地造成种子破损，严重时导致种皮脱落，造成发芽率降低；随着种皮透性的增加，种子进入吸水膨胀期后，种子仍暴露在温度较高的环境下，对种胚造成了一定伤害，甚至导致小部分种子死亡，造成发芽率降低；种子在温水中浸泡快速吸胀，浸种时间过长易导致吸胀损伤，活力下降，造成发芽率降低。响应面分析法一般用来优化一些提取工艺和流程参数[23]，将响应面分析法应用于优化蒙古黄芪的种子处理方式，与各个因素梯度的正交试验寻求最优处理方式相比，可以减少试验的次数，减轻试验的工作量。响应面分析得出浸种温度对蒙古黄芪种子发芽率的影响最高，原因可能是蒙古黄芪种子存在一个破除休眠的临界温度和致死温度，当外界温度高于致死温度时种子死亡，低于临界温度则对休眠破除影响较小，只有浸种温度在两者之间才能有效提高蒙古黄芪种子的发芽率。与程瑶等[17]研究结果相吻合。

另外本试验磨砂处理采用的方法是砂纸打摩，但在大规模生产实践中，砂纸打摩会带来很多的不便，因此可以用小型电动磨米机或种子摩擦机打磨代替砂纸打摩，原则是不伤及种仁，只破坏种皮即可。在观察发芽率期间发现了滤纸变黄现象，应该是种子内源抑制物浸出所致，应及时对滤纸进行更换。

4 结 论

本研究中通过对磨砂时间、浸种温度、浸种时间进行单因素筛选和响应面优化，最终确定蒙古黄芪种子处理方式是磨砂时间13 min、浸种温度56 ℃、浸种时间8 min，在此处理方式下蒙古黄芪种子发芽率达90.7%，与预测值92%相近，比起单因素试验能显著提高蒙古黄芪种子的发芽率。所优化的处理方式合理、可行，能为生产实践提供参考。