具核梭杆菌致病性及防治＊

胡婷婷,傅思武,金 悦，张 祎，马桂燕

（西北民族大学医学院，甘肃 兰州 730030）

随着人们对微生物群落在人类疾病中的认识不断加深，对F.nucleatum 的研究已有一个世纪之久，从先后毒力因子的研究，FusoPortal（http://fusoportal.org）梭杆菌属基因组、蛋白质分析储存库的逐渐建立[1]，人们对这类梭杆菌的研究正在形成一套系统的模式。F.nucleatum 作为肠道菌群，其致病性尤其在CRC 致癌方面发挥着越来越重要的作用，同时消化系统疾病仍然是未来钻研的方向。鉴于其具体的致病及相关化疗耐药机制还在研究中，同时缺乏对其明确的防治手段，本文就最近主要在其致癌方面研究作一介绍，为后续工作提供参考。

1 F.nucleatum 与消化系统疾病

1.1 口腔

F.nucleatum 是口腔生物膜重要组成部分，借助其自身表面不同黏附素以及特殊的生物学形态，可以与多种口腔代表菌共聚合，以及与多种口腔宿主细胞发生作用，在口腔中常导致早期炎症的发生。口腔鳞状细胞癌（OSCC）可以出现在口腔任何部位，其发病率以及致死率居各类口腔癌首位，Al-hebshi等[2]通过检测OSCC 组织切片和口腔上皮组织中各细菌基因富集程度，发现各细菌之间在种、属上均具有显著差异，其中F.nucleatum 多形亚种、铜绿假单胞菌和弯曲杆菌相关性最强，在对照组中发现，ATP 结合蛋白、8-oxoG 三磷酸酶等在基因代谢途径中过表达。F.nucleatum 感染OSCC 细胞Tca8113 引起DNA 双链断裂损伤（DSB），当细胞修复不足时，则通过激活Ku70/p53 通路致舌鳞癌细胞增殖，促使OSCC 发生[3]。人牙龈成纤维细胞(HGFs)是牙龈结缔组织中最丰富的固有细胞，研究[4]发现，F.nucleatum通过刺激一种AKT/MAPK 和NF-κB 信号通路，致HGFs 细胞凋亡、细胞内活性氧（ROS）和促炎细胞因子显著增加，并提出了其初步致病机制。F.nucleatum能够通过调控MIR4435-2HG/miR-296-5p/Akt2/SNAI1 信号通路，在正常和癌变的口腔上皮细胞中触发上皮间质转化（EMT），可能推动了OSCC 进展[5]。

血管反应是牙周疾病重要免疫过程，F.nucleatum 直接作用于血管内皮细胞，会刺激CD31、血管内皮生长因子等的改变，从而抑制了内皮细胞的增殖 和 成 管 能 力[6]。El-Awady 等[7]使 用SEM 评 估 了F.nucleatum、格氏链球菌和牙龈卟啉单胞菌体外成膜能力，三者之间协同作用促进了对人单核细胞来源的树突状细胞（MoDCs）的侵袭性，破坏DC 成熟，在牙周炎患者血液中约99%的F.nucleatum 是由PanDCs 携带，其对DC 参与牙髓根尖周疾病等的免疫应答可能产生影响。最近提出了梭菌CEACAM 结合蛋白(CbpF)的概念，其具体功能还未得到定义，但鉴定了F.nucleatum 能借助黏附素TAA 靶向人类CEACAM1，参与对牙龈组织的定植和侵袭，其中以具核和文森氏亚型表现突出[8]。

1.2 食管

食管中的正常菌群以链球菌属为主，质子泵抑制剂(PPI)、膳食营养、胃内容物环境等因素可能会使食管微生物结构改变。其中食管癌（esophagus cancer，EC）是最为常见的恶性肿瘤之一，我国90%的食管癌为鳞状细胞癌（ESCC）。Yamamura等[9]用qPCR 法对325 例EC 组织中F.nucleatum定量检测，有74 例组织F.nucleatumDNA 检测阳性，其与肿瘤分期显著相关，而与年龄、性别、肿瘤位置等不相关，尤其在晚期ESCC 中F.nucleatum 感染更显著[31]，在进一步分析中CCL20 是上调最多的炎症趋化因子，该因子由F.nucleatum 激活产生并增加了肿瘤侵袭力。Liu 等[10]在284 份EC 组织中发现，F.nucleatum 感染阳性组比阴性对照组含有较高水平的ULK1 和ATG7 表达，两者都参与细胞自噬调节。

1.3 化脓性肝脓肿

F.nucleatum 引起的肝脓肿较为少见，但这种感染是潜在的，并可迅速进展。口腔卫生状况可能是其感染的主要原因，而与免疫力、年龄等因素相关性较小[11]。Hooshmand[12]等研究表明，F.nucleatum 慢性炎症过程中，会导致亚急性感染患者出现类似放线菌样病变，表现为肝组织广泛坏死和纤维化，外科脓肿引流和抗生素治疗是其主要治疗方法。

1.4 IBD

IBD 主要包括克罗恩病(Crohn's disease，CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)，有关F.nucleatum 诱导IBD 发生的机制还不清楚。有研究[13-15]证实，F.nucleatum 同样在CD 和UC 中富集，通过靶向CARD3 分子的上调，介导内质网ERS 通路激活，促进肠黏膜屏障的破坏导致CD 发生[13]。CARD3 作为重要节点，其通过NOD2 激活体内外IL-17F/NFκB 途径，促进IL-1β、IL-6、IL-17F 和TNF-α 等炎性细胞因子表达，促使UC 发展[14]。另有研究[15]发现F.nucleatum 诱导M1 巨噬细胞极化，通过AKT2途径分泌大量炎性因子TNF-α、IFN-γ 等，损害肠道粘膜上皮屏障，增加肠道渗透性和细菌易位，导致炎症增加和疾病的进展。

1.5 CRC

CRC 是第三大最常见的癌症，在CRC 患者唾液、结直肠组织和粪便中F.nucleatum 均有较高水平表达，CRC 检出率在10%～90%之间[21]。CRC 与F.nucleatum 的关系是近年来讨论的焦点，流行病学调查中，不同国家和地区之间的研究多数是CRC 与正常大肠组织中F.nucleatum 丰度的比较，其关联性研究的检测方法和结果存在差异，同时也提出了是否与种族、抗生素的使用等有关[16]。而直至目前，其参与CRC 癌变的机制仍未完全阐明。基于Gholizadeh等[17]与Goradel 等人[18]提出的F.nucleatum 毒力因子(Fap2、FadA、LPS)、免疫调节因素、miRNAs 和细菌代谢四种机制，在此做一概括和扩展。F.nucleatum 自转运蛋白Fap2 结合存在于NK 细胞和T 细胞上的抑制性受体TIGIT，进而抑制NK 细胞和T 细胞活性，肿瘤借此发生免疫逃逸现象[19]，对此，提出该观点的Gur C 在其另一项研究中表明，可以考虑用CEACAM1 和TIGIT 抑制剂，特异性靶向治疗由F.nucleatum 定植的肿瘤[20]。Fap2 的另一个受体是位于结肠细胞表面的Gal-GalNAc，它是F.nucleatum 富集、CRC 定位的标志物，其有望成为新的治疗靶点[17]。

黏附素FadA 参与E-cadherin/β-catenin 途径，一方面激活IL-6/8/18 等促炎因子，另一方面刺激癌基因如Myc 等表达。Rubinstein 等[21]提出FadA 可通过E-cadherin 诱导Wnt/β-catenin 通路继而上调Annexin A1 的表达，Annexin A1 在CRC 细 胞中特异存在，是预后不良的预测因子，Annexin A1 表达上调的患者预后更差，该模型通过驱动体细胞基因突变和F.nucleatum 感染的“双hit”扩展了其致癌模型。miRNAs 能参与肿瘤细胞迁移、增殖、侵袭和分化，F.nucleatum 参与miRNAs 调控时，在CRC 组织中，与癌症信号相关的基因TP53、JUN、PRKACB等表达失调，而miR-4474/4717 通过CREBBP 靶基因转录后，可调控CRC 的进展，该分析表明，CREBBP 是F.nucleatum 诱导CRC 异常表达的主要基因[22]。F.nucleatum 感染肠黏膜产生ROS 等炎症因子，致使CpG 岛的高甲基化（CIMP）、肿瘤高度微卫星不稳定性（MSI-H）和hMLH1 甲基化等CRC 的遗传和表观遗传异常[23-25]，在MSI-H 的CRC 中富含CD4+/CD8+T 细胞、NK 细胞等具有抗肿瘤的淋巴细胞，即MSI-H 的患者预后免疫评分也越高；而另一方面，F.nucleatum 入侵CRC 致DNA 损伤（如8-oxoG），或产生的IL-6、PGE2 可能诱导了MSH3 从CRC 细胞核向细胞质转移，导致MSI-L、EMAST，与非MSI-H 和非MSI-L、EMAST 的CRC 相比，MSIL、EMAST 的无复发生存率（recurrence-free survival，RFS）更短[23]。

CRC 转移是大多数患者死亡的主要原因，研究[26]发现，F.nucleatum 通过上调CARD3 和激活自噬途径，刺激CRC 细胞中自噬小体形成、自噬相关蛋白表达等促进了CRC 转移，F.nucleatum 丰度与CARD3 表达呈正相关。CARD3 在F.nucleatum 诱导的IBD 炎症发生、CRC 自噬调节中存在关联，但具体机制还不明确。

2 其他相关疾病

目前主要与消化系统疾病发生发展的研究明显日趋增加逐渐深入，其中又以对CRC 的致癌性为焦点。既往与F.nucleatum 相关的其他系统疾病研究相对较少，但仍然存在潜在感染致病风险。在8.8%的胰腺癌组织中存在F.nucleatum，与胃癌也有一定关联[17]。在以后研究中，F.nucleatum 成为全身致病的共同因素会达成共识，尤以其致癌性应深入探究。

3 防治措施

3.1 免疫治疗

从口腔到胃肠道，大多数口腔微生物由口腔沿消化道异位定植是频繁连续的过程，肠道微生物组的组成可显著影响免疫治疗和化疗的反应。针对F.nucleatum 引起的各类感染性疾病，应更多靶向其毒力因子或致病信号通路节点研发药物。F.nucleatum代谢产生的H2S 不仅带来口腔异味，还会增强细胞的抗氧化能力，降低机体对抗生素的敏感性，Wang等人[27]从鸡蛋黄中提取出lgY 针对口腔异味进行了疗效评估，选择适宜浓度的lgY 对F.nucleatum 引起的口臭和牙周炎有治疗作用。烷基过氧化氢还原酶亚单位C（AhpC）可保护专性厌氧菌免受过氧化氢类物质的侵害，Guo 等人[32]发现F.nucleatum 感染阳性CRC 患者血清中的抗体能特异性识别重组蛋白Fn-AhpC，通过预防性免疫小鼠，77.3%的小鼠IgG水平升高；且AhpC 比F.nucleatum 的外膜孔道FomA 蛋白具有更强免疫反应，AhpC 序列与宿主和共生菌的同源性也较低或适中，如此或将AhpC 作为对抗肠道内F.nucleatum 感染提供了一种具有可行性的备选疫苗。Liu[33]等报道了以自转运蛋白为主的F.nucleatum 的外膜囊泡（OMV）蛋白质组学特征，利用OMVs 暴露的抗原表位对F.nucleatum 的疫苗设计生产和有效预防CRC 带来巨大潜力。

3.2 化疗

目前CRC 的治疗包括手术、化疗和放疗。化疗耐药是肿瘤顽固性复发的原因之一。F.nucleatum 通过TLR4/MyD88 依赖机制，调控miR-18a×/4802 在F.nucleatum 培养的细胞中选择性缺失，分别诱导自噬原件ULK1、ATG7 激活，导致CRC 细胞自噬，促使CRC 细胞对奥沙利铂、5-氟尿嘧啶(5-FU) 的耐药，增加了CRC 患者的耐药性[28]，此外，这一机制还通过调节NF-κB、P65 等因子，显著上调CRC 细胞HCT116 和HT29 中凋亡抑制蛋白BIRC3 的表达，BIRC3 抑制了caspase-3 对CRC 的凋亡作用，促进晚期CRC 对5-FU 的耐药，同时也检测到低水平的RFS 与F.nucleatum 和BIRC3 的 高 表 达 有 关[29]。Anoctamin-1(ANO1)为一种氯离子通道蛋白，在多种肿瘤中表达上调，F.nucleatum 通过与F.nucleatum共培养的HCT116 和HT29 促进了CRC 细胞中ANO1 的表达，而ANO1 的过表达阻止了奥沙利铂、5-FU 诱导的凋亡效应[30]。局部晚期的ESCC 宜先适用新辅助化放化疗（NAC），其次手术治疗，F.nucleatum 的高表达与ESCC 的RFS 相关，影响到NAC 疗效时，抗生素早期干预有助于改善治疗[31]。

3.3 噬菌体

在如今多耐药菌增加的情况下，噬菌体抗菌疗法已正在成为一种具有前途的治疗手段。之前报道过噬菌体FnpΦ2 的分离鉴定，以及F.nucleatum 亚型中的温和性噬菌体ΦFunu1 和ΦFunu2 的基因组特征的研究，最近从F.nucleatum 中分离出一种新型噬菌体FNU1，通过对其形态学、基因组学、功能特征研究发现对F.nucleatum 生物膜有裂解破坏作用[34]，这些噬菌体有望成为探究CRC 以及牙周炎等致病线索以及未来的补充代替治疗。此外，已有相关研究[35]机构利用合成生物学技术，对已识别的噬菌体进行优化并最终达到根除CRC 中F.nucleatum 的目的。

3.4 其他

脯氨酸羟化酶(prolyl hydroxylases，PHDs)抑制剂——二甲基乙二酰基甘氨酸（DMOG）可降低多种炎症性疾病死亡率，研究[36]发现，DMOG 可抑制由F.nucleatum 诱导HGFs 产生的炎症因子的表达，可能为控制牙周病的发生和发展提供新的治疗策略。

4 小结

综上所述，现阶段对F.nucleatum 的研究主要集中在以口腔疾病和CRC 为中心的消化系统疾病，在此探讨了分子机制方面的致病效应，后续还需投入更多对其他相关疾病机制的深究，尤其是对CRC 的致癌模型仍待进一步修正完善，对F.nucleatum 各亚型致病力还需鉴别。结合目前看，防治手段还没有成熟，针对肿瘤患者逐年攀升、化疗耐药等因素，都警醒人们新药研发迫在眉睫。未来在加快其机制研究的同时还需积极探索诊断、防治、预后等措施。