球等鞭金藻的异养培养

（烟台大学生命科学学院，山东 烟台 264005）

在水产养殖中，金藻、硅藻等微藻不仅可作为水产动物开口饲料或幼鱼饵料，还可净化水体，吸收铵盐等物质，对铵氮及亚硝酸盐的硝化有促进作用[1]。目前，微藻的大规模商业化培养主要在光生物反应器和户外开放性培养中进行。光生物反应器有占地面积大、生产周期长、藻类生长密度较低等缺陷，生产成本较高；户外开放培养有产量低、质量低、CO2补加困难、收获成本高、易被其他生物污染、对水质要求过高等问题，限制了微藻的应用及发展[2]。

金藻（Isochrysis）体积小，繁殖快，营养丰富，在水产动物鱼苗中有重要作用。球等鞭金藻 (Isochrysis galbanaParke 3011) 是水产育苗中常用饵料生物，有细胞膜薄、无细胞壁、蛋白质含量高、易被鱼虾蟹贝类消化吸收的特点，广泛应用于水产经济动物生产[3]。在生物反应器中异养培养球等鞭金藻，则金藻可利用加入的有机碳源、氮源进行细胞生长繁殖，生产有用物质。异养培养可克服金藻户外开放式养殖和光生物反应器培养的诸多缺陷，有微藻生长速度更快、可实现纯种培养、单位体积产率高、便于自动化控制等优势[4]。目前，以小球藻、硅藻等异养研究居多，对金藻异养的研究主要集中在碳源筛选和不同培养方式的对比，杨静等[5]在外加碳源异养及不同培养方式下，筛选出球等鞭金藻适合异养；Yousef A等[6]比较自养、异养和混养，发现等鞭金藻更适合混合培养。张帆[7-8]对球等鞭金藻 (Isochrysis galbanaCCMM5001) 进行避光异养培养15 d，其细胞密度为7.24×106mL-1，仅为自养培养的1.08倍，其研究主要利用微藻获得高附加值，并未关注异养培养如何获得高生物量的活体金藻。为获取高密度的金藻，缩短培养时间，实现纯种化培养，本课题组通过避光异养培养球等鞭金藻，筛选异养培养基[3]。笔者进一步研究碳氮源种类及浓度对异养培养等鞭金藻3011的影响，为微藻大规模异养培养研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 藻种

球等鞭金藻3011，由中国海洋大学微藻种质库（MACC）提供。

1.2 金藻培养

自养培养：在500 mL三角瓶中加入200 mL f/2培养基，接种50 mL金藻种子液，放入光照培养箱中，以24 ℃、160 r/min条件培养2周。

异养培养：以KS(G)异养培养基[8]为基础培养基，海水配制：每升海水中加入葡萄糖10.0 g，NaNO31.0 g，NaH2PO40.12 g，Na2SiO30.2 g，微量元素Na2EDTA 10 mg、H3BO310 mg、MnCl22.0 mg、CuSO40.1 mg、CoCl20.05 mg、FeCl310 mg、ZnSO40.1 mg。所配制培养基用0.5 mol氢氧化钠溶液pH调整为7.0，于121 ℃下灭菌30 min，冷却后加入维生素B120.05 mg/L，备用。在500 mL三角瓶中加入200 mL灭菌异养培养基，接种50 mL金藻种子液，放入MQD-B3R培养箱（上海枫岳商贸有限公司）中以30 ℃、160 r/min避光培养，当藻细胞生长进入平稳期或一周后停止实验，每12 h取样测定微藻生物量。

1.3 碳源异养培养实验

分别以10.0 g/L的葡萄糖、蔗糖、甘油、乙酸钠、淀粉、乙醇，以及10 g/L葡萄糖、9.5 g/L蔗糖、10.22 g/L甘油、13.67 g/L乙酸钠、9 g/L淀粉、7.67 g/L乙醇（碳元素浓度0.333 mol/L）作为基础培养基的碳源，进行等碳源浓度及等碳元素浓度两个实验，均以不加碳源的培养基为对照，在1.2的条件下进行微藻培养，每个实验组均设置3个平行组，考察不同碳源种类及碳源浓度对球等鞭金藻异养培养的影响。

1.4 氮源异养培养实验

分别以1.0 g/L的NaNO3、NH4NO3、NH4Cl、(NH4)2SO4、尿素、酵母浸粉、胰蛋白胨，以及1.0 g/L NaNO3、0.47 g/L NH4NO3、0.63 g/L NH4Cl、0.78 g/L(NH4)2SO4、0.35 g/L尿素、1.37 g/L、酵母浸粉、1.17 g/L胰蛋白胨为氮源，进行等氮源浓度及等氮元素浓度两个实验，均以不加氮源的培养基为对照，在1.2的条件下进行微藻培养，每个实验组均设置3个平行组，考察不同氮源种类及氮源浓度对球等鞭金藻异养培养的影响。

1.5 磷源异养培养实验

按照磷元素相等的原则，分别以0.12 g/L NaH2PO4、0.142 g/L Na2HPO4、0.136 g/L KH2PO4作为基础培养基的磷源，以不加磷源的培养基为对照，在1.2的条件下进行微藻培养，每个实验组均设置3个平行组，考察不同磷源种类及磷源浓度对球等鞭金藻异养培养的影响。

1.6 异养培养金藻生物量测定

将藻液稀释成浓度梯度，在680 nm处测其光密度（OD）值，同时用血细胞计数板计数（用乙醇或甲醛将藻固定，至少计数3次）。以OD值为横坐标，细胞密度（104mL-1或105mL-1）为纵坐标作图，建立细胞密度与光吸收值曲线。每天同一时间段摇匀并吸取藻液5 mL，测定OD值，如浓度过大，需稀释测定，根据细胞密度与光密度曲线，换算细胞密度。

比生长速率μ计算：

式中，Nt，td时的细胞数量；N0，初始细胞数量；t，培养时间。

采用干质量法[9]测定微藻生物量。取藻液于8000 r/min下离心6 min，弃上清，加蒸馏水洗涤，离心，重复两次，移藻泥至表面皿，涂匀，于-40 ℃冰箱预冻。冷冻真空干燥12 h，取出称质量。

1.7 数据处理

使用SPSS20.0 分析实验数据，结果以平均值±标准差表示，并作单因素方差分析和Duncan多重比较，P＜ 0.05 时差异有统计学意义，使用Origin作图。

2 结果与分析

显微观察发现，球等鞭金藻的自养培养藻液呈金黄色（图1），异养培养藻液呈白色，藻细胞较小，自养条件下微藻细胞直径为4.5～5.0 μm，异养条件下仅为2.0～3.0 μm，且微藻活动性减弱。

图1 自养和异养培养的球等鞭金藻Fig.1 Isochrysis glalban under autotrophic and heterotroph

2.1 碳源对球等鞭金藻异养培养的影响

2.1.1碳源种类对球等鞭金藻异养培养的影响 图2可见，与对照组相比，不同实验组金藻多在培养36～48 h左右进入对数生长期，不同碳源条件下，球等鞭金藻生长表现不同，以甘油和乙醇为碳源时，培养过程中金藻生物量基本未增加，不适合作为异养碳源；乙酸钠为碳源时，金藻生物量增长缓慢。以淀粉、葡萄糖和蔗糖为碳源时，金藻生物量增长明显。

在同碳源浓度实验中，培养96 h后，除葡萄糖组仍处生长期外，各组均进入平稳期，因此提前结束实验。图2（1）可见，淀粉对金藻异养培养的促进作用显著低于葡萄糖和蔗糖，培养72 h，淀粉组金藻密度为1.3×109mL-1，低于葡萄糖组的2.4×109mL-1，而蔗糖组培养60 h藻细胞浓度即达到2.2×109mL-1，之后生物量逐渐降低。以葡萄糖为碳源，培养96 h时，藻细胞密度达到3.8×109mL-1。同碳元素浓度组实验表明，葡萄糖对金藻异养培养的促进作用最佳，培养96 h，藻细胞密度即达到7.19×108mL-1，蔗糖次之（P＜ 0.05）。两组实验均表明，异养条件下葡萄糖更易被异养的球等鞭金藻吸收利用，即葡萄糖为微藻异养培养的最佳碳源。

图2 碳源种类对球等鞭金藻异养培养的影响Fig.2 Effect of carbon source types on the heterotrophic culture of Isochrysis glalban

2.1.2碳源浓度对球等鞭金藻异养培养的影响 葡萄糖浓度对金藻生长的影响见图3。金藻异养培养到42 h进入对数生长期，之后藻细胞浓度随葡萄碳质量浓度的升高而逐渐升高，在40 g/L时到达拐点，之后开始逐渐下降。葡萄糖质量浓度为10、20 g/L时，金藻生长较缓慢，培养96 h时，葡萄糖质量浓度为40、50、60、70 g/L 四组藻细胞密度均在5×109mL-1左右，无显著差异（P＞ 0.05），培养到144 h时，各组有明显差异（P＜ 0.05），其葡萄糖质量浓度为40 g/L时，达到1.2×1010mL-1，测得生物量为22.16 g/L，为金藻异养培养的最适葡萄糖浓度。

图3 葡萄糖浓度对球等鞭金藻异养培养的影响Fig.3 Effect of glucose concentration on the heterotrophic culture of Isochrysis glalban

2.2 氮源对球等鞭金藻异养的影响

2.2.1氮源种类对球等鞭金藻异养的影响 在同氮源浓度实验中，98 h后除尿素组仍处生长期外，各组均进入平稳期，因此提前结束实验。图4可见，与对照组相比，不同氮源对球等鞭金藻异养培养均有不同程度的促进作用，以NH4NO3、NH4Cl、(NH4)2SO4、酵母浸粉、胰蛋白胨为氮源，金藻生长缓慢，藻细胞密度较低。图4（1）中，尿素组与其他实验组在98 h时均有显著性差异 (P＜ 0.05)。以尿素和NaNO3作为氮源，培养前80 h藻细胞密度相差不大，比生长速率相近，分别为4.72%和4.47%，培养至98 h尿素组微藻密度达9.6×109mL-1（生物量为18.35 g/L），高于NaNO3组的7.1×109mL-1。

同氮元素浓度组实验表明，NH4NO3作为氮源对金藻异养培养有一定促进作用，前120 h胰蛋白胨、NaNO3和尿素组微藻的生长状况相近，120 h后尿素组微藻生物量高于NaNO3和胰蛋白胨组，在144 h分别达2.2×1010、1.79×1010、1.48×1010mL-1，生物量分别为38.56、31.87、26.84 g/L；因此，尿素是球等鞭金藻异养培养的最适氮源。此外，金藻快速繁殖时大量消耗氮源，有机氮源中，尿素含氮量最高且价格便宜，是金藻异养培养合适选择[10]。

2.2.2氮源浓度对球等鞭金藻异养的影响 以40 g/L葡萄糖作为碳源，不同尿素浓度下微藻的生长情况见图5。藻细胞密度随时间增加而增加，培养98 h时藻细胞密度达7.0×109mL-1左右。98 h后，尿素质量浓度为0.2 g/L组，由于氮源耗尽，金藻密度有所下降。其他浓度组，以质量浓度1.0 g/L组生长最佳，培养98 h时藻细胞密度可达9.7×109mL-1，170 h可达1.8×1010mL-1，测得生物量为22.16 g/L。

图4 氮源种类对球等鞭金藻异养培养的影响Fig.4 Effect of nitrogen source types on the heterotrophic culture of Isochrysis glalban

图5 尿素浓度对球等鞭金藻异养培养的影响Fig.5 Effect of urea concentration on the heterotrophic culture of Isochrysis glalban

2.3 磷源对球等鞭金藻异养的影响

2.3.1磷源种类对球等鞭金藻异养的影响 以40 g/L葡萄糖为碳源、1.0 g/L 尿素为氮源进行微藻异养培养，不同磷源下的金藻生长状况见图6。与对照相比，3种磷源均对金藻异养有不同程度促进作用，在96 h达到平稳期。KH2PO4组藻细胞密度分别与Na2HPO4组和NaH2PO4组存在显著性差异（P＜ 0.05）。培养96 h 时，KH2PO4组藻细胞密度达2.13×1010mL-1，测得生物量为37.42 g/L。之后各组进入平稳期，藻细胞密度逐渐下降，在144 h，KH2PO4和NaH2PO4组藻细胞密度均在6.7×109mL-1左右，无显著差异（P＞ 0.05）。

图6 磷元素浓度对球等鞭金藻异养培养的影响Fig.6 Effect of phosphorus concentration on the heterotrophic culture of Isochrysis glalban

2.3.2磷源浓度对球等鞭金藻异养的影响 以40 g/L葡萄糖为碳源、1.0 g/L尿素为氮源，不同磷元素浓度下的金藻生长状况见图7。1.0×10-4mol/L组与其他各实验组有显著性差异（P＜ 0.05），培养96 h 时，1.0×10-4mol/L组的藻细胞密度平均值达到最大，为2.13×1010mL-1，测得生物量为37.17 g/L。之后各组随时间增加，藻细胞密度逐渐下降。

图7 磷源浓度对球等鞭金藻异养培养的影响Fig.7 Effect of phosphorus source concentration on heterotrophic culture of Isochrysis glalban

3 讨论

3.1 碳源对球等鞭金藻的影响

碳源是微藻异养生长最关键的影响因素，选择合适的碳源对微藻异养培养的生物量和产物组成有极为关键的作用。不同的微藻对碳源需求不同，葡萄糖因易吸收，被普遍作为异养碳源。Ip Po-Fung等[11]采用混养培养方式培养小球藻（Chlorella zofingiensisde），当以葡萄糖作为唯一碳源，质量浓度为30 g/L时，最适于该小球藻生长，小球藻密度达最高，可获得高产量虾青素。张帆[7]筛选2.0 g/L葡萄糖为异养培养等鞭金藻的最适碳源。

本研究中，以葡萄糖或蔗糖为唯一碳源，在一定浓度范围内均可促进金藻异养生长，这可能与避光条件下单糖和双糖更有利于金藻的吸收利用有关。与其他微藻异养[7,11]相同，葡萄糖为异养培养金藻的最适碳源，当葡萄糖质量浓度为40 g/L时，藻细胞密度最高。在实际生产中，可采用糖蜜产品作为葡萄糖的替代品，在保证培养过程中葡萄糖供应的同时，还可进一步降低生产成本。

3.2 氮源对球等鞭金藻的影响

氮素是微藻生长必须基本元素之一，也是藻体内合成蛋白质、核酸及叶绿素等的主要成分。金藻对不同种类和形态氮源的吸收利用各异，并直接影响微藻的生长状况，姜永和等[12]研究发现，在氮源为150 mg/L硝酸钠，自养培养至后期的等鞭金藻生物量和蛋白质含量较高。艾江宁等[13]研究发现，当氮质量浓度为1.5 g/L时，自养培养湛江等鞭金藻的总脂肪质量分数和产量分别达到39.8%和0.92 g/L。本研究发现，硝酸钠和尿素对金藻的异养培养均有较强的促进作用，但尿素表现更佳，这可能是因为有机氮源比无机氮源更易被微藻吸收利用。在所研究的氮源中，尿素含氮量最高，选择尿素作为氮源不仅成本低，且对金藻异养培养有良好的促进作用，适合在工业上作为金藻异养培养的氮源。

3.3 磷源对球等鞭金藻的影响

磷是核酸和细胞膜的重要组分，在细胞的能量转换中有重要作用。微藻异养以常用磷酸盐为磷源，异养状态下比自养状态下利用的磷更多[14]。本研究中，三类磷酸盐对金藻培养的促进作用差距不显著，KH2PO4组的小球藻培养效果较其他两类磷酸盐略佳。这可能是因为球等鞭金藻在摄入大量钠离子后，需通过吸收钾离子以稳定体内的渗透压。

3.4 光自养和异养培养方式的对比

异养培养条件下，球等鞭金藻3011可直接利用培养液中的有机物，不需进行光合作用，其繁殖速度远高于自养培养。培养98 h，自养培养金藻生物量为1.4×107mL-1左右[15]，而异养培养能高达2.13×1010mL-1。对于大规模生产，异养培养方式培养效率更高，培养时间更短。

从能源利用上来说，光自养需求大量高强度的光照，需足够的场地来架设灯管，光源利用率低，CO2补加困难，所得藻细胞密度低，收获成本高且易被其他生物污染。异养则需葡萄糖等有机物，在培养箱中培养，能源利用率高，纯种收获简单，不易出现污染[16]。在规模化培养中，异养培养是一种新方法。

4 结论

本研究考察避光条件下不同种类及浓度的碳源、氮源对球等鞭金藻3011生长的影响，结果表明，葡萄糖、尿素、KH2PO4分别是较为适合球等鞭金藻异养培养的碳源、氮源、磷源。在葡萄糖浓度40 g/L、尿素1.0g/L、KaH2PO413.6 mg/L时微藻培养效果最佳，细胞密度在培养48 h时可达109个/mL，培养96 h时可达到1010个/mL。相比于自养培养，异养状态下微藻生长更快。