益肾健脾泻浊中药对慢性肾脏病妊娠大鼠肾脏NLRP3/caspase-1/IL-1β信号通路及细胞焦亡的影响＊

冯桃花，刘文康，武 宁，何 珍，徐贺鹏，周文平，梁文杰，2，许庆友，2，王 筝，2，王香婷，2＊＊

（1. 河北中医学院 石家庄 050091；2. 河北省中西医结合肝肾病证研究重点实验室 石家庄 050091；3. 河北省中医院 石家庄 050000）

慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）流行病学研究表明，女性CKD 患病率急剧增加，CKD 影响约3%的孕妇[1]。2018 年世界肾脏日“关注肾脏病，关注女性健康”的主题提示女性肾脏健康已经成为全球关注的焦点。由于孕期肾脏血流动力学以及自身免疫功能的改变使得肾脏处于高灌注、高凝和高滤过状态，导致原有的肾脏病复发或加重[2-4]。有研究显示，妊娠前肾功能较差的妇女在妊娠期间血肌酐和肾小球滤过率异常更显著，蛋白尿、高血压都会增加肾衰的风险[5]。相比较CKD 1-2期的患者，CKD 3-5期患者早产率、剖宫产率、5 min 新生儿评分和新生儿重症监护病房住院率显著增加[6]，妊娠成为CKD 发生发展的重要因素。前期研究发现，妊娠诱导大鼠醛固酮分泌增多[7]，诱导的细胞增殖，促进肾间质纤维化进程[8]，同时观察到肾小球大量巨噬细胞聚集。在此基础上，本课题研究妊娠加重肾脏损伤的可能机制诱导巨噬细胞NLRP3 炎症小体活化，炎性介质释放，加重肾脏损伤。同时阐述以“脾肾亏虚，浊毒内蕴”为病机，以NF-κB/NLRP3/caspase-1/IL-1β为路径，给予醛固酮受体阻断剂及益肾健脾泻浊中药治疗,探讨益肾健脾泻浊中药对慢性妊娠肾病肾脏的保护作用以及对肾脏细胞焦亡的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及用药

雌性Wistar大鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司，其中雌性未经产大鼠90 只，雄性大鼠20只，8周龄，体质量（160±20）g。依普利酮购于美国辉瑞制药有限公司（生产批号024306），规格50 mg/片。益肾健脾泻浊中药药物组成：黄芪20 g，当归5 g，白芍12 g，山药15 g，桑寄生12 g，山茱萸15 g，土茯苓20 g，泽泻15 g，运用神威药业免煎中药配方颗粒(生产批号17103061，17102361，17091411，17062111，17052714，17081151，17061251，17032651），将药物混匀煎煮15 min，配成混悬液。

1.2 主要试剂与仪器

NF-κB p65 抗 体（servicebio 公 司 ，生 产 批 号181905）；NLRP3 抗体（novus 公司，生产批号 IMG-6665A）；Caspase-1 抗体（proteintech 公司，生产批号00019089）；IL-1β抗 体（abcam 公 司 ，生 产 批 号309542-23）；GAPDH 抗体（bioworlde 公司，生产批号54162）；TUNEL 试 剂 盒（Eterlife 公 司 ，生 产 批 号11422200）；Cr 试剂盒贝克（曼库尔特实验系统有限公司，生产批号AUZ3562）；BUN 试剂盒（曼库尔特实验系统有限公司，生产批号AUZ3611）；TP 试剂盒（Thermo Fisher Scientific 公司，生产批号23227）；ALD试剂盒（天津九鼎医学生物工程有限公司，生产批号RA21810）。小型垂直电泳槽、半干转印槽为Bio-Rad公司产品；病理图文分析系统DP7 2CCD，显微照相仪、BX53 显微镜产于 Olympus 公司；γ-放射免疫计数器FJ-2021，西安二六二厂。

2 方法

2.1 模型建立及动物分组

在前期实验中，慢性肾脏病动物模型主要参考Truong LD[9]等所写文献通过单侧输尿管结扎手术制备[10],并观察UUO 术后 1、2、4、8、12 周大鼠肾脏病理变化及血肌酐、尿素氮变化。结果显示：损伤至4 周，肾脏病理为炎性细胞浸润较少，细胞增殖，肾功能无变化；损伤至8周，大量的炎性细胞浸润，肾功能改变；12周大鼠血肌酐、尿素氮变化明显。研究显示，能否顺利妊娠与肾损伤程度相关，CKD1-2期，Scr ＜ 1.4 mg⋅dL-1，血压控制良好者，妊娠后GFR 变化不明显；CKD3-5期，Scr ＞ 1.4 mg⋅dL-1患者，高血压和先兆子痫风险显著增高，甚者导致肾衰竭。实验结果显示，首先，UUO 术后56天Scr与CKD3-5期肾脏损伤Scr值相符；其次，根据大鼠2.5-3年寿命，折算人类寿命80岁，大鼠56天大约为人类4-5年，符合慢性肾病病程（参考秦川主编的《实验动物学》）。综上，我们选择UUO 术后56 天复制慢性肾病模型，同时进行妊娠，复制CKD妊娠模型。

雌性Wistar 大鼠适应性喂养1 周，采用随机数字表法将其分为6组：正常妊娠组（SP）、单侧输尿管结扎组（UUO）、UUO+ 妊娠组（UP）、UUO+ 妊娠 + 依普利酮组（EPL）、UUO+妊娠 +益肾健脾泻浊方（TCM），每组各15 只；另取15 只作为对照组（Sham）。UUO 组采用单侧输尿管结扎手术复制慢性肾病模型，UUO 术后，EPL 组大鼠给予依普利酮100 mg⋅（kg⋅天）-1灌胃，TCM 组大鼠给予益肾健脾泻浊中药 3.11 g⋅（kg⋅天）-1（临床上按成人换算剂量转换系数6.25/114 g/天）灌胃。同时，Sham组给予相同体积的生理盐水。慢性肾病模型制备后8周，妊娠组及治疗组大鼠阴道涂片，动情前期、动情期进行合笼，记录阴栓脱落为妊娠第1天，妊娠第19 天处死母鼠。实验过程中，UUO 组因感染死亡 2 只，EPL 组死亡 1 只，UP 组死亡 1 只，因流产TCM组死亡1只，动物造模成功85只。

2.2 指标检测及方法

对照组及其他分组大鼠妊娠第18天最后1次灌胃后禁食并将其放入代谢笼，收集24 h尿液，1500 r⋅min-1离心5 min 分装，冻存至-20℃，用于检测24 h 尿蛋白。次日10%水合氯醛0.04 mL⋅g-1体重腹腔注射麻醉后，股动脉取血，将血液收集到无菌管中，室温静置20 min，4℃和8000 r⋅min-1条件下离心10 min，取上层血清后-4℃存储，用于检测血清醛固酮、血肌酐、尿素氮。摘取双侧肾脏，对比拍照后，将健侧肾脏浸入4%多聚甲醛 48 h，用于病理学 HE、Masson、TUNEL 及免疫组化染色，部分肾组织-70℃保存行蛋白检测。

2.2.1 肾脏组织病理染色

石蜡包埋、切片，二甲苯脱蜡3 × 15 min，梯度浓度乙醇进行水化，进行苏木精-曙红染色、Masson 三色染色，观察肾组织病理变化及评估纤维化水平。

2.2.2 各组大鼠醛固酮表达情况

检测各组大鼠的血清醛固酮及肾肾组织醛固酮含量，按照检测试剂盒说明书进行操作。

2.2.3 各组大鼠肾功能、24 h尿蛋白定量

按照血清检测试剂盒说明书进行操作，采用全自动生化分析仪检测血清肌酐（Scr）的水平，尿素酶-谷氨酸脱氢酶法测定尿素氮（BUN）水平，使用BCA 法进行24 h尿蛋白定量测量。

2.2.4 肾脏组织TUNEL染色

肾脏组织切片后经二甲苯脱蜡，酒精梯度水化，消除内源性过氧化物酶，柠檬酸缓冲液微波高火力1 min 进行破膜，孵育20%牛血清室温30 min 封闭组织，加入反应液（Enzy∶Lable=1∶9），阳性对照组只加入Lable，37℃孵育 60 min，PBS 清洗，滴加过氧化物酶（POD）37℃孵育 60 min，PBS 浸洗；镜下观察 DAB 显色，呈现浅黄色底色清水终止反应，蒸馏水冲洗5 min，苏木精复染细胞核，脱水透明封片；光镜下观察细胞核呈棕黄色为阳性表达，随机观察镜下（×400）不重复的20个视野，由焦亡细胞与总肾细胞的比率来计算肾细胞焦亡水平。

2.2.5 采用免疫组织化学法检测肾组织NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表达

切片，二甲苯10 min 脱蜡，梯度酒精脱水，加入3%过氧化氢15 min 以封闭内源性过氧化物酶，浸泡在枸橼酸缓冲液中，微波炉高火力20 min 进行抗原修复，室温冷却，PBS清洗后用山羊血清10 min处理以减少非特异性结合。将切片与一抗NF-κB p65（1∶500）、NLRP3（1∶2 00）、Caspase-1（1∶200）、IL-1β（1∶100）在4℃过夜；用酶标记的山羊抗小鼠/兔IgG聚合物进行二抗孵育，37℃孵育 15 min，PBS 清洗，滴加 SABC 复合物，DAB 显色，苏木精复染细胞核；酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片；镜下观察细胞核出现棕黄色或棕褐色深染为阳性表达。

2.2.6 蛋白质免疫印迹法检测肾组织NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1、IL-1β的蛋白表达

称量等量肾脏组织，采用4：1 比例加入裂解液裂解组织蛋白及蛋白酶抑制剂，在冰上剪碎组织，微波粉粹仪进行匀浆后静止30 min，4℃，8000 r⋅min-1离心10 min，静置15 min，提取上清并采用4∶1 比例加入蛋白缓冲液，煮蛋白5min 后进行分装并置-80℃冻存。起始以20 ug 蛋白进行上样，90-120 V 电泳，半干转膜25 min，室温5%脱脂牛奶封闭2 h，加入兔抗鼠一抗NF-κBp65（1∶500）、NLRP3（1∶1000）、Caspase-1（1∶500）、IL-1β（1∶1000），同时用 GAPDH（1∶20000）作为内参校正。4℃孵育过夜或室温孵育2 h，TBST 清洗8 min*3 次，室温孵育羊抗兔二抗（1∶20000）2 h，TBST清 洗 8 min*3 次 ，TBS 清 洗 1 次 。 使 用 Image studio Ver5.2系统进行定量分析。

2.3 统计学方法

采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，以均数±标准差()表示连续变量，符合正态性和方差齐性检验数据选择单因素方差分析，采用单因素方差分析SNK 法比较6组间差异。不符合正态检验条件采用秩和检验，方差不齐采用Tamhane、Dunnett T3方法统计。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠肾组织病理形态学改变

Sham 组肾小管形态正常，观察到微量炎症细胞。SP组病理炎症细胞浸润增加。UUO、UP组出现严重的肾小管扩张，上皮细胞脱落，细胞肿大，胞核染色质浓缩，染色质边集或细胞核消失，肾间质大量的炎细胞浸润，肾小管形态不完整。两组相比较，UP 病理改变明显。与UP组比较，EPL、TCM组病理损伤减轻（图1）。

图1 依普利酮及中药治疗CKD妊娠大鼠肾组织病理形态改变（×400）

Masson 三色染色显示，与 Sham 组对比，UUO 组肾小管间质及细胞外基质纤维化明显，UP 组进一步加重，通过EPL、TCM治疗后肾纤维化明显减少。

3.2 各组大鼠醛固酮含量测定

血清醛固酮及肾组织醛固酮含量评估盐皮质激素受体活化情况，与Sham 组相比SP有所增加，但无统计学意义；UUO组醛固酮显著增加（P＜0.05），UP组较UUO 组表达明显（P＜0.05），两给药组醛固酮含量显著下降（P＜0.05）。肾组织醛固酮检测结果显示，较Sham 组比较，SP 组表达增加，UP 组与 UUO 组比较显著增加（P＜ 0.05），两给药组均显著下调（P＜ 0.05），组间无明显差异（表1、图2）。

3.3 各组大鼠肾功能及24 h尿蛋白含量

运用血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）及24 h尿蛋白评估肾脏损伤，与Sham 组相比，BUN 及24 h 尿蛋白两个指标SP 组水平显著升高（P＜ 0.05），Scr 水平增加，但无明显差异。UUO 组各肾功能指标明显增加（P＜0.05），表明成功通过单侧输尿管结扎手术建立慢性肾病模型，与 UUO 组相比，UP 组 Scr、BUN 及 24 h 尿蛋白定量明显升高（P＜ 0.05），EPL 组和TCM 组BUN、24 h尿蛋白定量显著下降（P＜0.05），但组间无统计学意义。表明两用药组对慢性肾病妊娠导致的肾功能损伤有保护作用（表2、图3）。

表1 依普利酮及中药治疗改善CKD妊娠大鼠醛固酮含量(,n = 8)

表1 依普利酮及中药治疗改善CKD妊娠大鼠醛固酮含量(,n = 8)

注：与Sham组比较，＃P ＜ 0.05；与SP组比较，▲P ＜ 0.05；与UUO组比较，▽P ＜ 0.05；与UP组相比，*P ＜ 0.05

肾组织醛固酮/（ng⋅mL-1）0.593±0.126 0.797±0.139 1.007±0.255#▲1.587 ± 0.300#▲▽0.913±0.216#*1.001±0.308#*Group Sham SP UUO UP EPL TCM血清醛固酮/（ng⋅dL-1）7.625±0.475 8.486±0.549 11.336±0.549#▲12.816 ± 0.785#▲▽10.943±0.621#*11.288±0.514#*

图2 依普利酮及中药治疗改善CKD妊娠大鼠醛固酮含量

表2 依普利酮及中药治疗改善CKD妊娠大鼠肾功能(,n = 8)

表2 依普利酮及中药治疗改善CKD妊娠大鼠肾功能(,n = 8)

注：与Sham组比较，＃P ＜ 0.05；与SP组比较，▲P ＜ 0.05；与UUO组比较，▽P ＜ 0.05；与UP组相比，*P ＜ 0.05

24 h尿蛋白/（g⋅24 h-1）1.518±0.578 1.547±0.438#2.433±0.593#▲3.352 ± 0.625#▲▽2.352 ± 0.863#▲*2.435 ± 0.864#▲*Group Sham SP UUO UP EPL TCM尿素氮/（mmol⋅L-1）6.252±0.993 6.873±0.803#7.705± 0.896▲#8.557 ± 0.723#▲▽7.998±1.055#▲8.299±1.091#▲血肌酐/（μmol⋅L-1）56.958±5.067 61.716±6.712 65.261±5.489#73.849 ± 5.721#▽▲63.086±11.590*64.811±4.604#*

3.4 TUNEL 染色检测各组大鼠肾脏组织细胞DNA 损伤情况

SP 组较 Sham 组 TUNEL 阳性细胞表达增多（P＜0.05）；与 SP 组比较，UP 组 TUNEL 染色的细胞阳性率明显升高（P＜0.05），主要位于扩张的远端小管；与UP组比较，EPL、TCM 组的细胞阳性率较UP 明显下降（P＜ 0.05）（表3、图4）。

3.5 各组大鼠肾脏NF-κB p65表达情况

Sham 组大鼠肾脏NF-κBp65 在远端肾小管上皮细胞的细胞核中呈弱表达，与Sham 组比较，SP 组表达增加；与UUO 组比较，UP组表达增强（P＜ 0.05）；EPL、TCM 组与UP 组比较表达范围及强度均明显减弱（P＜0.05）（图5-图6）。

表3 TUNEL检测依普利酮及中药治疗CKD妊娠大鼠肾脏细胞DNA损伤情况, n = 8

表3 TUNEL检测依普利酮及中药治疗CKD妊娠大鼠肾脏细胞DNA损伤情况, n = 8

注：与Sham组比较，＃P ＜ 0.05；与SP组比较，▲P ＜ 0.05；与UUO组比较，▽P＜0.05；与UP组相比，*P ＜ 0.05

TUNEL阳性细胞率/%0.254±0.048 0.365±0.082 0.610 ± 0.075#▲*0.782 ± 0.024#▲▽0.578 ± 0.027#▲*0.605 ± 0.051#▲*Group Sham SP UUO UP EPL TCM

3.6 免疫组织化学法检测各组大鼠肾脏NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路分子表达情况

Sham 组大鼠肾脏 NLRP3、Caspase-1、IL-1β表达较弱；SP 组表达增强；UUO 组及UP 组表达明显增强，UP 组表达阳性表达强于 UUO 组；与 UP 组比较，EPL、TCM 组表达均明显减弱。NLRP3 主要表达于肾组织浸润的巨噬细胞和肾小管上皮细胞；Caspase-1 和IL-1β表达于肾远端小管上皮细胞胞浆（图7）。

图3 依普利酮及中药治疗改善CKD妊娠大鼠肾功能

图4 TUNEL检测依普利酮及中药治疗CKD妊娠大鼠肾组织DNA损伤情况（TUNEL，×400）

图5 依普利酮及中药治疗CKD妊娠大鼠肾组织NF-κBp65在肾小管上皮细胞的表达（SABC，×400）

图6 Western blot 检测依普利酮及中药治疗CKD妊娠大鼠肾脏NF-κBp65表达

3.7 蛋白质免疫印迹法检测各组大鼠肾脏NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路蛋白表达情况

与Sham 组比较，SP 组各项指标表升高，其中NLRP3、Caspase-1、IL-1β明显升高（P＜ 0.05）；与UUO组 比 较 ，UP 组 大 鼠 肾 脏 NLRP3、Pro-caspase-1、Caspase-1、Pro-IL-1β、IL-1β蛋 白 表 达 增 强（P＜0.05）；与 UP 组比较，EPL、TCM 组各项指标表达明显下调（P＜ 0.05）（表4、图8-图10）。

4 讨论

图7 依普利酮及中药治疗CKD妊娠大鼠肾组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β在肾小管上皮细胞的表达

表4 Western blot 检测依普利酮及中药治疗CKD妊娠大鼠肾组织NLRP3、Pro-Caspase-1、Caspase-1、Pro-IL-1β、IL-1β蛋白表达,n = 8

表4 Western blot 检测依普利酮及中药治疗CKD妊娠大鼠肾组织NLRP3、Pro-Caspase-1、Caspase-1、Pro-IL-1β、IL-1β蛋白表达,n = 8

注：与Sham组比较，＃P ＜ 0.05；与SP组比较，▲P ＜ 0.05；与UUO组比较，▽P ＜ 0.05；与UP组相比，*P ＜ 0.05

IL-1β/GAPDH 0.036±0.002 0.043±0.004#0.053±0.003#▲0.065 ± 0.004#▲▽0.045± 0.007▽*0.033± 0.004▲▽*Group Sham SP UUO UP EPL TCM NLRP3/GAPDH 0.247±0.038 0.308±0.028 0.502±0.017#▲0.717 ± 0.041#▲▽0.390± 0.048▽*0.450 ± 0.049#▲▽*Pro-caspase-1/GAPDH 1.023±0.180 1.070±0.210 1.456±0.160#▲1.668 ± 0.130#▲▽1.184±0.150▽*0.975±0.130▽*Caspase-1/GAPDH 0.301±0.110 0.512±0.220 0.740±0.210#0.984 ± 0.060#▲▽0.563 ± 0.220#▽*0.049 ± 0.120#▽*Pro-IL-1β/GAPDH 0.283±0.021 0.415±0.043 0.605±0.029#▲0.779 ± 0.043#▲▽0.432±0.069#*0.532±0.036#*

图8 Western blot检测依普利酮及中药治疗CKD妊娠大鼠肾组织NLRP3蛋白表达

妊娠期心输出血量增加，肾脏代偿性体积增大30%，有效肾血浆流量平均增加70-80%，肾小球滤过率增加50%。在妊娠期，凝血因子Ⅰ-纤维蛋白原Ⅶ、Ⅷ、Ⅹ增加,出现高凝状态。使肾脏处于高灌注、高滤过、高凝状态[11]，可造成CKD 患者肾脏器质性损害，使原有肾脏病变加重。慢性肾脏病妊娠患者易发妊娠期高血压疾病，其机制与RAAS 系统失衡有关。随着RAAS 的深入研究，发现下游的醛固酮可能发挥重要的介导作用。CKD 妊娠期间，醛固酮水平升高使得血浆容量增加，对于维持循环血容量，血压和子宫胎盘灌注至关重要[12]。肾脏损伤可激活RAAS，介导肾源性肾素分泌增多与胎盘产生雌激素作用于肝脏[13]，促进血管紧张素酶解，因而促进RAA S 主要效应分子AngⅡ的增加，发挥收缩血管，升高血压的作用。且有研究显示，醛固酮结合盐皮质激素受体引起肾损伤[14]，给以醛固酮受体阻断剂可以减轻糖尿病肾病[15]、慢性肾病、肾脏纤维化改变[16]。同时，醛固酮可介导炎性巨噬细胞聚集，上调炎性因子表达，激活NLRP3 炎症小体，诱导细胞焦亡。

NLRP3 炎症小体识别受损和垂死细胞释放的内源性危险信号，在调节CKD 肾脏炎症中发挥作用[17]。NF-κB 信号通路活化及损伤相关分子模式（PAMPs）可为NLRP3提供激活信号，NLRP3激活后发生自身寡聚化，募集ASC 及Pro-caspase-1 组装成为炎症小体，Pro-caspase-1 自身剪切成为成熟的Caspase-1，活化的 Caspase-1 切割 Pro-IL-1β和 Pro-IL-18，产生成熟的具有生物学活性的 IL-1β和 IL-18[18]。Toshiki 等据报道，醛固酮可诱导大鼠NLRP3炎性体表达增加并导致肾细胞焦亡[19]。细胞焦亡（Pyroptosis）是1 种新型促炎程序性细胞死亡，介于凋亡和坏死之间，其特征是DNA 损伤和膜穿孔[20]，由 Caspase-1 介导，焦亡细胞TUNEL 染色阳性，提示其DNA 发生断裂损伤。NLRP3/ASC/Caspase-1/IL-1β/IL-18 轴活化诱导细胞焦亡，加重肾脏炎症损伤。

图9 Western blot检测依普利酮及中药治疗妊娠大鼠肾组织Pro-caspase-1、Caspase-1蛋白表达

图10 Western blot 检测依普利酮及中药治疗CKD妊娠大鼠肾组织Pro-IL-1β、IL-1β蛋白表达

妊娠加重慢性肾病肾脏损伤，属于中医“子满”“子眩”“虚劳”“胎气”等。临床主要症状为水气，身重且以腰下肿甚，小便不利，水道不通，阳虚水湿不化，水湿内停，化生浊毒。根据慢性肾病发病特点，结合妊娠的特殊生理变化，素体脾肾亏虚，孕后血聚养胎，胎儿夺精伤母，气血亏耗，唐·昝殷所著《经效产宝》亦认为，“脏气本弱，因产重虚，土不克水。血散入四肢，遂致腹胀，手足面目皆浮肿，小便秘涩”。根据慢性肾脏病脾肾亏虚，浊毒内蕴的病机，结合妊娠特殊的生理变化，治疗以治病与安胎并举，确立益肾健脾泻浊法，方药由黄芪、当归、白芍、山药、山茱萸、桑寄生、土茯苓、泽泻组成。方中以补五脏诸虚的黄芪，补益脾肾，为君药。山茱萸补养肝肾，取“肝肾同源”之意；配伍山药补益脾阴，亦能固肾，共为臣药。孕后气以载胎，血以养胎，方中黄芪与当归以5∶1 的比例配伍，寓“当归补血汤”补益气血之意，扶助正气，有形之血生于无形之气，使气旺血生。白芍养血益阴，为血中之血药配当归，加强补血之力；配伍桑寄生补肾安胎。本虚得固，胎儿得养。黄芪益气推动水液运行，兼可利水。配伍泽泻，以其甘淡，直达肾与膀胱，利水渗湿而泄肾浊。佐入土茯苓，味甘、淡，性平，入络以渗利下导为务，以去湿浊。诸药配伍，标本兼顾。全方共奏益气健脾、养血泻浊之功，采用此方加减治疗慢性肾炎、肾病综合征缓解期妊娠病人，尿蛋白未见增多，亦未出现妊娠中毒症状。本方的配伍特点：一是脾肾同治，重点在后天，使脾旺则气血生化有源，气行则湿化。二是气血并补，但重在补气，意在气为血之帅，气旺则血自生，血足则胎儿有所养。三是补益与祛湿并行，佐以泽泻、土茯苓甘淡利湿，表邪得去。

现代研究显示，黄芪具有抗炎、抗氧化应激损伤、免疫调节等作用，黄芪甲苷有效降低妊娠期高血压，缓解血管内皮损伤引起的氧化应激和炎症因子水平，改善肾组织细胞损伤[21]。黄芪可有效改善创伤应激大鼠肠黏膜免疫功能及NLRP3 炎症小体的致炎作用[22]。Deng YP 等发现白芍总苷可下调NLRP3、caspase-1、IL-1β、ASC 蛋白表达，抑制细胞焦亡通路[23]。土茯苓具有清热解毒、除湿、通利关节等作用，临床广泛应用于治疗慢性肾衰竭，现代研究表明其具有抗抗炎、免疫调节、抗氧化等丰富的药理学活性[24]。临床上采用此法加减治疗慢性肾炎、肾病综合征妊娠病人，获得较为满意的临床效果。

在本研究中，单侧输尿管梗阻妊娠大鼠增加醛固酮分泌，结合盐皮质激素受体，进一步使NF-κB 信号通路活化，实验结果显示NF-κB P65 主要在肾远端小管，蛋白表达同步增加，促进Pro-IL-1β等炎性因子的分泌；同时NLRP3/caspase-1/IL-1β信号通路蛋白表达增加，提示NLRP3 炎症小体及Caspase-1 前体及成熟的蛋白活化，促进Pro-IL-1β切割成为具有致病力的IL-1β炎症因子的产生。结果说明，单侧输尿管梗阻妊娠大鼠肾脏中存在焦亡，并且提示炎症小体家族中NLRP3 炎症小体是焦亡的重要标志，NLRP3 炎症小体蛋白的增加促进IL-1β炎症因子表达；同时，TUNEL染色观察DNA 损伤情况进一步佐证这一结论，单侧输尿管梗阻大鼠DNA 断裂百分比上升，UP 组较UUO 组阳性细胞数量增加13%，说明肾脏梗阻可以诱导肾脏细胞焦亡，妊娠是加重慢性肾病的独立因素。MR 阻断剂依普利酮及益肾健脾泻浊方药有效改善NF-κB 及NLRP3／caspase-1／IL-1β信号通路蛋白表达，提示可以通过盐皮质激素受体阻断剂（EPL）抑制盐皮质激素受体及以上蛋白的表达，减少其下游炎性介质的释放。进一步说明，慢性肾病患者妊娠刺激Ald 分泌增多，通过MR 活化-巨噬细胞浸润-NF-κB/NLRP3-细胞焦亡为途径介导炎性损伤。

据此，慢性肾病妊娠上调醛固酮含量，通过NF-κB 信号通路及 NLRP3/Caspase-1/IL-1β轴,诱导细胞焦亡，调控肾脏炎症损伤。醛固酮阻断剂依普利酮可以有效的通过抑制Ald-MR/NF-κB/NLRP3-Caspase-1-IL-1β通路。益肾健脾泻浊中药可抑制NF-κB通路和NLRP3 炎症小体活化，减少诱导细胞焦亡，减轻炎症损伤，从而发挥肾脏保护作用。