巴里黄檀心材色素成分及其稳定性和抗氧化性*

杨雨桐 张卿硕 符韵林 孙 静

1.广西大学资源环境与材料学院 南宁 530004； 2.广西大学林学院 南宁 530004)

色素是当代生产生活中的一种重要添加剂，被广泛应用于食品、药品、个人护理和纺织等领域。按来源不同，色素可分为天然色素和人工合成色素两大类，其中，人工合成色素多是从煤焦油等化工产品中提炼出来的，其种类多、色泽鲜艳、成本低廉、着色力强，但提炼过程中有可能混入砷、汞、苯胺等物质； 天然色素是从动、植物中提取并经加工获得的，对人体较为安全，毒性较小或无毒，但由于其来源少、价格高、着色力差，使用并不广泛。相比人工合成色素，天然色素除了生态友好、无毒无害等优点外，还具有一定的保健功能。近年来，随着科技的不断发展和人们对健康重视程度的日趋提升，越来越多的天然色素走向工业化生产的道路，并被投放于市场。目前，文献报道及应用于生产的木本植物源色素多来自植物果实(果皮和种皮)、茎叶与树皮，如从红木(Bixaorellana)种皮中提取的胭脂树橙色素(Alczaretal.， 2017)、板栗(Castaneamollissima)壳棕色素(Yaoetal.， 2012)、橘皮黄色素(Aravantinosetal.， 2010)，从红花檵木(Loropetalumchinensevar.rubrum)叶中提取的红色素(唐克华等， 2005)，从落叶松(Larixgmelinii)树皮中提取的红色素(Duetal.， 2005)等。一些木材心材由于多酚类物质积累，颜色较深，因此也可从中提取色素(Blancaetal.， 2004； Gutiérrezetal.， 2014)，多酚类物质具有多种生理活性，如抑菌(Youetal.， 2014)、抗氧化(Hongetal.， 2018)、抗肿瘤(Bierhausetal.， 1997)、预防心血管疾病(Palasuwanetal.， 2005)等。将木材心材小粒径废料(如锯末刨花)中的多酚类物质提取出来，用作色素应用于生产生活，有着广阔的市场前景和研究价值；但当前关于木材心材有色抽提物的研究多集中于木材变色、心材发色机制等方面，从心材中提取色素的研究较少。

巴里黄檀(Dalbergiabariensis)为豆科(Fabaceae)黄檀属(Dalbergia)乔木，心材新切面呈紫红褐或暗红褐色，常带黑褐或栗褐色细条纹，继降香黄檀(D.odorifera)、交趾黄檀(D.cochinchinensis)和檀香紫檀(Pterocarpussantalinus)红木“老三样”资源枯竭后被大量应用于高档家具和工艺品制作中(翟东群等， 2014)，但由此产生的加工余料、刨花、锯末等多被燃烧，其潜在价值完全被忽视。交趾黄檀、降香黄檀为同属树种，心材含有大量黄酮类物质，具有抗菌防腐、防癌抗氧化、治疗心血管疾病等保健作用(Palasuwanetal.， 2005； Choietal.， 2017)。郭丽冰等(2008)采用硅胶柱色谱分离、核磁鉴定等方式从降香黄檀的乙酸乙酯部位中分离鉴定出8种化合物，其中异甘草素、柚皮素、芒柄花素均被证明具有消炎、抗肿瘤的药理活性(Jietal.， 2017； 季鹏等， 2015； Chulwonetal.， 2018)。刘荣华等(2015)采用相同方式从交趾黄檀中分离鉴定出14种异黄酮类成分，其中美迪紫檀素可通过激活棕色脂肪细胞中的蛋白激酶A促进脂肪分解(Imranetal.， 2018)，染料木黄酮具有诱导肝癌细胞死亡的活性(Lietal.， 2017)。但未见巴里黄檀心材成分鉴定及其利用的相关报道。

鉴于此，本研究以巴里黄檀木制品加工废料(刨花)为试验材料，从中提取色素，分离鉴定色素成分，探究色素的稳定性和抗氧化性，以期为充分利用巴里黄檀资源提供理论基础和技术支撑，为同类红木资源的高效利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

巴里黄檀刨花采自广西凭祥刘吉利红木厂，经广西大学鉴定为巴里黄檀的心材部分。试剂主要包括甲酸、甲醇、无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、氯化钡、氯化钙、硫酸铜、氯化钾、氯化镁、氯化钠、氯化铁、氯化铝、重铬酸钾、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐、过硫酸钾、Vc、氢氧化钠、稀盐酸、芒柄花黄素标准品(上海源叶生物科技有限公司)。高效液相色谱仪所用试剂为色谱纯，其余均为国产分析纯，水为蒸馏水和超纯水。

1.2 研究方法

1.2.1 心材刨花预处理 捡除刨花中的杂质，筛除灰尘，经粉碎机粉碎后过60目筛，50 ℃真空干燥至恒重，密封避光保存。

1.2.2 色素提取工艺流程 巴里黄檀心材木粉→70%乙醇恒温搅拌抽提→抽提液离心→减压浓缩→加水混悬→石油醚萃取除杂→乙酸乙酯萃取→减压浓缩→干燥→巴里黄檀心材色素。

1.2.3 心材色素成分检测 使用超高效液相色谱(UltiMate3000液相色谱，Dionex公司)-串联四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱(Q Exactive四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪，Thermo公司)法(UPLC-Q-EXACTIVE-MS)对巴里黄檀心材色素成分进行分离鉴定。

超高效液相色谱(UPLC)条件： ACQUITY UPLCBEHC18色谱柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)，柱温30 ℃； 正离子(ESI +) 模式； 流动相A为0.1%甲酸水，流动相B为甲醇。样品梯度洗脱条件见表1。自动进样器温度4 ℃，进样体积1 μL。

表1 样品流动相梯度洗脱条件

高分辨质谱(Q-EXACTIVE-MS)条件： 加热型电喷雾(HESI)离子源； 温度300 ℃； 正、负离子模式下喷雾电压均为3.0 kV； 传输毛细管温度320 ℃； 鞘气压206.85 kPa； 辅助气压68.95 kPa； 扫描模式为Full MS和Full MS/dd-MS2，质量范围100～500m/z； 一级、二级扫描分辨率分别为70 000和17 500。

分别配制浓度1、5、10、20、100、1 000 μg·L-1的芒柄花黄素、甲醇溶液，上样，建立浓度标准曲线，计算溶液中芒柄花黄素的相对含量。

1.2.4 心材色素稳定性测定 1) pH对色素稳定性的影响 取20 mL色素溶液于比色管中，分14组分别加入1 mol·L-1盐酸溶液、1 mol·L-1NaOH溶液，调节pH至1～14，可见光区波长范围内扫描色素溶液并绘制曲线。

2) 金属离子对色素稳定性的影响 采用蒸馏水分别配制0.1 mol·L-1BaCl2、CaCl2、CuSO4、KCl、MgCl2、NaCl、FeCl3、AlCl3、K2Cr2O7溶液，取1 mL金属盐溶液于20 mL色素溶液中，振摇均匀，可见光区波长范围内扫描色素溶液并绘制曲线。

3) 温度对色素稳定性的影响 取20 mL色素溶液于刻度试管中，分别于60、70、80 ℃下加热1、2、3、4、5 h，冷却定容后测定溶液吸光度。

4) 紫外光照对色素稳定性的影响 取40 mL色素溶液于盛液盒中，密封，置于加速老化试验机内，以464.44 lux紫外光持续照射，每隔1 h取样1次，共6 h，避光冷却后测定溶液吸光度。

1.2.5 心材色素抗氧化性测定 1) DPPH自由基清除率测定 采用无水乙醇配制0.2 mmol·L-1DPPH-乙醇溶液，精确量取3 mL溶液于具塞试管中，分别加入3 mL浓度为40、80、120、160、200 mg·L-1的色素溶液，振摇均匀，室温下避光静置30 min，于517 nm处测定溶液吸光度。采用与色素同浓度的Vc水溶液为阳性对照。DPPH自由基清除率计算公式如下：

式中：Ai为不加样品只加DPPH的吸光度；A为加样品和DPPH的吸光度；A0为加样品不加DPPH的吸光度。

2) ABTS自由基清除率测定 配制7 mmol·L-1ABTS和4.9 mmol·L-1K2S2O8溶液，等体积混合、摇匀，黑暗处静置12 h，获得ABTS母液，于734 nm处测定溶液吸光度，使用无水乙醇调节吸光度至0.700±0.002。将50 μL浓度分别为200、400、600、800、1 000、1 200、1 400 mg·L-1的样品加入到5 mL ABTS溶液中，摇匀后避光静置15 min，于734 nm处测定溶液吸光度。ABTS自由基清除率计算公式如下:

式中：Ai为不加样品只加ABTS的吸光度；A为加样品和ABTS的吸光度；A0为加样品不加ABTS的吸光度。

2 结果与分析

2.1 巴里黄檀心材色素成分

根据UPLC-Q-EXACTIVE-MS检测分析结果，得到心材色素各成分的保留时间和质谱信息，通过与mzcloud比对二级质谱信息，结合文献，共鉴定出19种黄酮类成分，其中染料木素、芒柄花黄素、柚皮苷、美迪紫檀素、黄豆黄素在同属植物降香黄檀心材成分中已有报道(Fengetal.， 2011； Leeetal.， 2013)。郭丽冰等(2007)筛选降香黄檀的有效药理部位，发现活血止血的有效药理部位为水提取液的乙酸乙酯部分，这说明在心材成分利用方面，如檀木药茶，巴里黄檀可能对降香黄檀有潜在替代性。

正、负离子模式下总离子流见图1，成分信息见表2。

图1 巴里黄檀心材色素 UPLC-Q-EXACTIVE-MS的正离子(A)和负离子(B)质谱基峰离子流

得到芒柄花黄素的浓度标准曲线为y=1 524 816.84x+ 22 189 263.00，R2= 0.998，色素中芒柄花黄素的相对含量为2.27%。

2.2 巴里黄檀心材色素稳定性

2.2.1 pH对色素稳定性的影响 巴里黄檀心材色素溶液pH=6。与空白样品对比，酸性条件下(图3)，色素在可见光区波长范围内的强吸收波段基本不变，吸光度随pH降低而增大，说明酸性条件对色素稳定性影响较小，色素中含有天竺葵素、矢车菊素等花青素，花青素会随着溶液pH降低而变红(吴敏等， 2008)，故酸性条件对色素具有一定增色作用。碱性条件下(图4)，色素最大吸收峰发生蓝移，在400 ～450 nm波段有强吸收，色素颜色由红色向黄绿色转变，pH>9时产生沉淀，这是因为花青素在碱性条件下变蓝，且黄酮类物质酚羟基的H+被Na+取代，对色素结构造成一定破坏。可见，色素适宜在酸性至中性条件下储存使用，不宜接触碱性物质。

2.2.2 金属离子对色素稳定性的影响 如图5所示，KCl、BaCl2、NaCl、MgCl2、CaCl2对色素基本无影响，AlCl3对色素有增色作用并生成少量黄色络合物，FeCl3、CuSO4、K2Cr2O7使色素溶液产生沉淀并变色，破坏较大。这是因为色素的主要成分为黄酮类物质，K+、Ba2+、Na+、Mg2+、Ca2+的氧化性较弱，不会与色素发生反应； Al3+的氧化性中等，低浓度Al3+对色素影响较小； Fe2+、Cu2+、Cr6+的氧化性较强，能与黄酮类物质的酚羟基反应生成有色配合物并沉淀，与植中强等(1999)研究天然色素对金属离子稳定性的影响结论一致。天然染料用于织物染色时常以金属离子作为媒染剂，起增色、固染、提高上染率的作用(韩晓俊等， 2007)，因此巴里黄檀色素用于织物染色时，K+、Ba2+、Na+、Mg2+、Ca2+可作为媒染剂使用。

表2 巴里黄檀心材色素中黄酮类成分离子结构信息

图3 酸性条件对巴里黄檀心材色素的影响

图4 碱性条件对巴里黄檀心材色素的影响

2.2.3 温度对色素稳定性的影响 如图6所示，60和70 ℃时色素吸光度变化幅度相对较小，色素较为稳定； 80 ℃时色素在2 h内较稳定，随着时间增长色素吸光度逐渐增大，颜色加深，色素稳定性下降。与众多天然色素相同(全桂静， 2017； Inggridetal.， 2016)，巴里黄檀心材色素在低温下稳定而高温下稳定性降低，这是因为高温促使黄酮类物质的酚羟基氧化，生成有色醌类物质，颜色加深(Bekhtaetal.， 2003)。因此，巴里黄檀心材色素不宜长时间处于高温状态下，长时间高温加热会使其成分发生改变，稳定性下降。

图6 温度对巴里黄檀心材色素稳定性的影响

2.2.4 紫外光照对色素稳定性的影响 将色素溶液置于紫外光老化仪(QUV加速老化试验机，Q-LAB公司)内，以464.44 lux紫外光(相当于双倍的夏季正午光照)照射，结果(图7)显示，随着紫外光照时间增加，色素吸光度上升，紫外光照对色素有缓慢增色作用，这是因为黄酮类物质的酚羟基吸收紫外光生成酮基自由基，再与氧气结合后生成有色醌类物质，颜色加深。心材色素氧化后颜色变深，与木材氧化颜色变深现象一致，木材中酚类抽提物的氧化变色也被认为是木材变色的主要来源之一(Changetal.， 2014)。

图7 紫外光照对巴里黄檀心材色素稳定性的影响

2.3 巴里黄檀心材色素抗氧化性

2.3.1 色素对DPPH自由基的清除能力 如图8所示，巴里黄檀心材色素对DPPH自由基具有一定清除能力，在60 mg·L-1浓度范围内呈一定线性关系，160 mg·L-1浓度时对DPPH自由基的清除率可达87.25%。这是因为色素中黄酮类物质A、B环上有多个酚羟基，C-2与C-3之间有双键，还有自由的C-3-羟基和酮基，酚羟基可与自由基反应生成较稳定的半醌式结构，能够终止自由基链反应(鲁晓翔， 2012)，表现出一定抗氧化性。此外，心材色素中多种物质如芒柄花黄素、染料木素等也均有抗氧化性(张永忠等， 2008)。巴里黄檀心材色素为巴里黄檀乙醇溶液抽提物的乙酸乙酯部位，与其同属植物降香黄檀的抗氧化活性部位一致(姜爱莉等， 2004)。

图8 巴里黄檀心材色素与Vc对DPPH自由基清除率的影响

2.3.2 色素对ABTS自由基的清除能力 如图9所示，巴里黄檀心材色素对ABTS自由基也具有一定清除能力，在600 mg·L-1浓度内呈一定线性关系，1 400 mg·L-1浓度时对ABTS自由基的清除率可达63.73%。

图9 巴里黄檀心材色素与Vc对ABTS自由基清除率的影响

3 结论

本研究从巴里黄檀木制品加工废料(刨花)中提取色素，使用超高效液相色谱-串联四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-Q-EXACTIVE-MS)法分离鉴定色素成分，对色素主要成分进行定量，探究pH、金属离子、温度和紫外光照对色素稳定性的影响，分析色素对DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力。从巴里黄檀心材色素中共鉴定出19种黄酮类成分，包括荭草素、葛根素、牡荆素、异鼠李素、天竺葵素、矢车菊素、高车前素、白杨素、黄豆黄素、蓟黄素、樱花素、柚皮苷、染料木素、锦葵素、香叶木素、美迪紫檀素、芒柄花黄素、高丽槐素和6-羟基黄酮，其中芒柄花黄素相对含量为2.27%。心材色素在酸性至中性环境下较为稳定且有一定增色作用，碱性条件对色素破坏性较大，PH>9时产生沉淀。金属离子K+、Na+、Ba2+、Ca2+、Mg2+对色素影响不显著，Al3+对色素有增色作用但产生少量络合物，Fe2+、Cu2+、Cr6+对色素结构造成破坏并使其产生沉淀。温度70 ℃以下对色素稳定性影响不显著，超过70 ℃，加热2 h以上色素稳定性降低，颜色加深。6 h内紫外光照对色素稳定性影响不显著，长时间光照可能使色素颜色缓慢加深。心材色素对DPPH、ABTS自由基均具有一定清除能力，可作为抗氧化剂使用。巴里黄檀心材色素提取方法简单，具有保健功能，但也有天然色素不稳定的特点，在使用时应控制条件，并适当添加稳定剂，以便更好利用。从巴里黄檀心材加工剩余物中提取色素，可为充分利用巴里黄檀资源提供理论基础和技术支撑，并为同类红木资源的高效利用提供参考。