氮沉降对米槠天然林土壤有机碳及微生物群落结构的影响

刘春华，吴东梅，刘雨晖，陈 辉，沈宝贵，蒋宗垲，刘小飞＊

(1. 福建农林大学莘口教学林场，福建 三明 365002；2. 福建师范大学地理科学学院，福建 福州 350007)

随着农业生产化肥使用的增加和化石燃料燃烧等人类活动的加剧，使通过大气进入陆地生态系统的氮（N）不断增加[1-2]，已严重影响陆地生态系统碳（C）循环等关键生态学过程[1-4]。森林土壤C 库是陆地生态系统土壤C 库的主体（占70%），在缓解全球气候变化中发挥重要作用[5-6]。因此，森林土壤有机碳（SOC）库如何响应N 沉降这一问题引起研究人员的极大关注[6-9]。研究表明，SOC 对N 沉降的响应主要表现为增加、降低和无影响[8-11]。大量研究结果表明，N 沉降能增加土壤N 的有效性，提高植物的生产力和通过凋落物、细根向土壤输入的碳，进而增加SOC 积累[6,10]；也有研究表明，N 沉降通过抑制SOC 的分解来增加土壤碳，如N 沉降能降低木质素真菌的丰度和木质素降解细胞外酶活性，进而降低SOC 分解速率[8,10-11]。另有研究表明，土壤pH 值在影响微生物生物量和土壤碳周转方面起着主要作用，较低pH 值能抑制微生物活性，进而降低SOC 分解[12-13]。然而，可溶性有机碳（DOC）作为碳循环中的重要组成部分[14]，在SOC 形成中起着重要作用，但在N 沉降背景下，DOC 在SOC 吸存中的作用尚不清楚。

土壤微生物参与了土壤大部分的生物地球化学循环过程，在森林生态系统碳氮循环过程中起关键作用[5,14]。研究表明，N 沉降能改变土壤微生物群落结构[15-16]。由于细菌比真菌更喜欢利用碳氮比（C/N）较低的C 源，N 沉降降低土壤C/N，有利于土壤细菌生长[17]。Meta 分析结果也表明，N 增加显著降低微生物生物量、细菌、真菌生物量和微生物呼吸 。Wu 等 研究发现，经过8 a N 沉降试验后，土壤严重酸化，植被物种丰富度降低，进而导致丛枝真菌微生物量含量下降，细菌生存胁迫指数增加。然而，这些研究结果主要来自温带地区，与温带地区不同，亚热带森林土壤N 相对饱和[20]。因此，N沉降的增加对微生物及其群落结构的影响及其机制可能与温带不同。

有关亚热带森林生态系统对N 沉降的响应已有许多研究，但这些研究主要集中在亚热带人工林中[21-22]，而针对亚热带顶级群落的常绿阔叶天然林的相关研究仍较少[8]。我国亚热带地区生物多样性高、生产力高，是我国重要的森林碳汇基地，而米槠(Castanopsis carlesii(Hemsl.) Hayata.)是本区域地带性顶级群落主要树种之一。本研究通过野外模拟不同N 沉降水平，探讨土壤有机碳含量和可溶性有机碳以及微生物群落结构的变化，以便能够更准确地理解N 沉降对亚热带常绿阔叶林生态系统碳汇功能的影响，为预测未来森林生态系统对全球变化的响应与适应提供实地观测数据和理论基础。

1 试验地概况

试验地位于福建省三明市格氏栲自然保护区（26°11′ N，117°28′ E）的米槠天然常绿阔叶林（约200 年无人为干扰），海拔315 m。该区域属于亚热带季风气候，夏季高温多雨，冬季低温少雨，年均气温19.4℃，年均降水量1 700 mm（多集中于3—8 月）。植物群落种类丰富且层次分明，其中，乔木主要有米槠、木荷（Schima superbaGardner et Champ.）、马尾松（Pinus massonianaLamb.）、虎皮楠（Daphniphyllum oldhamii(Hemsl.)K. Rosenthal）等，且米槠为优势种。土壤类型为砂岩发育的山地红壤，土壤容重为1.12 g·cm-3，土壤全碳、全氮、全磷和全钾含量分别为24.5、1.86、0.21、2.9 g·kg-1。2011 年调查林分时，林分密度为1 955 株·hm-2，郁闭为0.89 度，树高为11.9 m。

2 研究方法

2.1 试验设计

2011 年6 月，在米槠天然林内设置12 个20 m ×20 m 样地，相邻2 个样地间隔10 m 作为缓冲区。试验采用随机区组设计，设置对照（CK，0 kg·hm-2·a-1）、低氮（LN，40 kg·hm-2·a-1）、高氮（HN，80 kg·hm·a）3 种处理（2011 年N 沉降 背 景 值36 kg·hm-2·a-1），每 处 理4 个 重 复，N 沉降量分每月等量（全年分12 次）喷洒至相应样地。每月月初将硝酸铵（NH4NO3）溶于20 L 蒸馏水，利用喷雾器均匀喷洒至相应样方内，对照处理喷洒等量蒸馏水，减少因外加水造成的森林生物地球化学循环的影响。N 沉降于2012 年10 月开始实施。

2.2 土壤采集与处理

2016 年7 月，利用直径2 cm 土钻在各处理样地中采集0～10、10～20 cm 土样。在每个样地内选择10 个点采集土壤样品混合成一个样品，放在冰袋中立即带回实验室。然后，去除动植物残体、小石子等杂质并过2 mm 筛。样品分为2 部分，一部分-20℃冷藏用于分析土壤微生物生物量，另一部分风干用于土壤理化性质的分析。

2.3 土壤理化性质及微生物测定

土壤总有机碳（SOC）、总氮（TN）使用元素分析仪直接测定（Elementar Analyzer Vario EL IV，德国）。用去离子水按照水土比4:1 提取土壤可溶性有机碳（DOC），混合液放入震荡仪震荡30 min（7 g），然后放入高速离心机内离心15 min（1 370 g），最后提取上层清液并过0.45 μm 滤膜，滤液利用总有机碳分析仪（TOC-VCPH/CPN，Shimaszu，日本）测定DOC 含量。土壤硝态氮（NO3--N）、铵态氮（NH4+-N）使用氯化钾（KCl）按水土比4:1 提取，采用连续流动分析仪（Skalar san++，荷兰）测定。土壤pH 值使用去离子水按水土比2.5:1 提取，搅拌后静置等溶液澄清后，采用玻璃电极测定（STARTER 300，OHAUS，美国）。

土壤微生物群落结构采用磷脂脂肪酸（PLFAs）法测定[16]，称4 g 鲜土，经过脂类抽提、脂类分离、甲脂化后，所得溶液采用气相色谱仪（Agilent 6890 N，美国）测定，同时结合MIDI微生物识别系统（MIDI, Inc., New-ark，DE），根据各脂肪酸组分峰值保留时间确定微生物种类，微生物PLFA 表征[23]见表1。

2.4 数据统计与分析

对所有的数据进行正态性检验（Shapiro-Wilk 检验），有必要时对数据进行对数转换。对不同处理之间土壤基本理化性质和各类微生物生物量的差异显著性进行多重比较（LSD 检验）。运用混合线性模型评估N 沉降和土层对土壤基本理化性质和各类微生物生物量的影响，N 处理和土层作为固定因子，区组作为随机因子，显著性水平设定为p＜ 0.05，混合线性模型采用R 包nlme。用Pearson 相关系数分析在N 沉降水平下不同土层土壤理化性质和各类微生物生物量及总微生物生物量的相关性；采用主成分分析（PCA）法分析微生物群落结构差异性；采用随机森林模型计算土壤理化性质和微生物对土壤有机碳影响的相对重要性，使用R 包RandomForest 进行随机森林计算，利用R 包rfPermute 检测各影响因素重要性的p值。所有统计分析均在R (R.3.6.1)软件中完成。

表1 表征微生物的PLFAsTable 1 PLFAs characterizing microbes

3 结果与分析

3.1 N 沉降对土壤基本理化性质的影响

0～10 cm 土层中，与CK 相比，LN 处理显著提高了SOC、TN、NO3--N、DOC 含量和C/N，而土壤pH 值和NH4+-N 含量无显著变化；HN 处理土壤pH 值显著增加，NO3--N 含量增加约1 倍，而对SOC、TN、DOC、NH4+-N 含量和C/N 比无显著影响（表2）。

表2 不同施氮处理下不同土层土壤基本理化性质的变化Table 2 Changes of soil properties under different nitrogen level addition treatments in different layer

10～20 cm 土层中，与CK 相比，LN 处理土壤pH 值显著降低，而其他理化性质均无显著变化；HN 处理后土壤NH4+-N 含量显著增加，而pH 值和DOC 含量显著降低，其他理化性质无显著变化（表2）。

混合线性模型分析结果（表2）表明：N 沉降对SOC、DOC、NO3--N 和pH 均有显著影响，而土层对各个土壤理化性质参数均有显著影响；此外，NO3--N 和pH 受N 沉降和土层交互作用的影响，而对其它理化性质不存在交互作用。

3.2 N 沉降对土壤微生物总磷脂脂肪酸（PLFAs）含量及群落结构的影响

图1 表明：0～10、10～20 cm 土层中，不同N 沉降水平处理下，土壤细菌PLFAs 含量显著大于真菌和放线菌PLFAs 含量。不同N 沉降水平对同一土层中不同类群微生物PLFAs 含量的影响不同；同时，土层深度也是影响各类群微生物PLFAs含量的一个重要因素。

图1 不同施氮处理下不同土层土壤微生物PLFAs 含量Fig. 1 PLFAs concentration of soil microbial groups in different N level addition treatments in different layer

0～10 cm 土层中，与CK 相比，LN 处理的总PLFAs 以及革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、丛枝菌根真菌、放线菌、真菌和细菌的PLFAs 含量分别增加25.4%、27.5%、24.9%、29.1%、26.3%、22.4%、26.2%，而对GP/GN 和F/B无显著影响，HN 处理与LN 处理的结果类似(图1）。10～20 cm 土层中，与CK 相比，LN 处理革兰氏阳性菌的PLFAs含量降低18.3%，而对其它微生物类群、GP/GN和F/B 均无显著影响，HN 处理对各类微生物及总PLFAs 含量均无显著影响(图1)。

3.3 微生物群落结构及土壤有机碳变化的影响因子分析

主成分分析结果（图2）表明：前2 个主成分解释了微生物群落结构的84.9%，其中，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）的解释度分别为74.9%和10.0%。N 沉降显著影响0～10 cm 土壤微生物群落结构，而对10～20 cm 土层土壤微生物群落结构无影响。此外，0～10、10～20 cm 土层间土壤微生物群落结构差异显著，并且与是否N 沉降处理无关。

图2 不同施氮处理下土壤微生物PLFAs 主成分分析Fig. 2 Principal component analysis of PLFAs composition of microbial community under different nitrogen level addition treatments

Person 相关性分析（表3）发现：在0～10 cm土层中，除革兰氏阳性菌外，其余各类微生物类型及总PLFAs含量与SOC、TN 呈显著或极显著正相关；土壤DOC 与除放线菌外的其他各类微生物类型的PLFAs 含量均呈显著正相关；土壤真菌PLFAs含量与C/N 呈显著正相关。与0～10 cm 相比，10～20 cm 土层中各菌群PLFAs 含量与氨氮、硝氮、SOC、TN、pH 以及DOC 含量无明显相关性。

表3 土壤微生物PLFAs 含量与土壤理化指标相关性分析Table 3 Correlations between soil PLFA content and soil physical and chemical indicators

随机森林模型结果（图3）表明：DOC、TN、C/N、总PLFAs、细菌、丛枝菌根真菌和放线菌是驱动SOC 变化的主要因素，随机森林模型能解释SOC 变化的93%（p＜ 0.001）。

图3 影响土壤有机碳（SOC）含量变化因子的相对贡献Fig. 3 The relative contributions of driving factors on SOC

4 讨论

4.1 N 沉降对土壤有机碳的影响

本研究结果表明，与CK 处理相比，LN 处理表层（0～10 cm）土壤有机碳含量增加27.4%，而HN 处理对土壤有机碳含量无显著影响（表2），这与其它野外观测和模型预测结果类似[9,11,24]。Frey 等[11]对哈佛森林长达20 a N 沉降研究表明，N 沉降使土壤有机质层有机碳含量增加高达80%，其主要由于N 沉降能降低土壤微生物生物量、活性和改变土壤有机质化学结构，进而降低对土壤有机碳的矿化作用[6,8]，但此机制并不能解释本研究的结果，本研究中土壤微生物生物量并没有降低反而增加（图2）。本研究中，N 沉降导致SOC 含量增加的可能原因如下：第一，0～10 cm 土层中，LN 处理土壤DOC 含量比CK 增加51%（表2），DOC 含量的增加为微生物提供了大量的碳源，促进了微生物的生长和繁殖（图1）；随机森林模型结果表明，DOC 含量与土壤中的细菌、真菌、放线菌的PLFAs 和总PLFAs 是影响SOC 最重要的因素（图3），这些因素可以解释SOC 变化的93%（图3）。第二，SOC 与土壤微生物总PLFAs 及其各组分呈显著的正相关（表3）；同时，本试验地之前的研究结果表明，LN 沉降增加微生物生物量，同时提高了土壤微生物的呼吸[25]，土壤微生物的周转加快，而HN 处理刚好相反；微生物周转加快产生大量的微生物残体碳，而微生物残体碳是土壤有机碳的重要来源之一[26]，LN 沉降增加了0～10 cm 土壤氨基糖含量[27]，这也可能是本研究中土壤有机碳含量增加的重要因素之一。第三，细根是土壤有机碳的重要来源之一，前期相关研究结果表明，LN 处理显著提高了0～10 cm 细根生物量，而HN 处理无显著影响[28]，而大量的细根输入也可能是导致LN 处理土壤有机碳含量增加的主要因素之一。综上所述，本研究中，LN 处理增加了土壤DOC 含量、细根生物量、土壤微生物生物量并加速了微生物周转，这些因素共同作用进而使LN 处理土壤有机碳含量显著增加，但HN 处理对这些因子的影响不显著，导致土壤有机碳含量未发生改变。此外，本研究中，LN 沉降短期内（4 a）0～10 cm 土壤有机碳含量比CK 增加了27.4%，其累积速率比温带地区快，这可能与亚热带地区土壤生物化学循环速率较快有关，但其驱动机制是什么？而不同剂量N 沉降对土壤有机碳的影响是否具有长期效应？这些问题仍有待于进一步的研究。

4.2 N 沉降对土壤微生物生物量及群落结构的影响

本研究结果表明，N 沉降显著增加了0～10 cm土层土壤总PLFAs 及其各微生物类群的PLFAs，而对10～20 cm 土层各类微生物PLFAs 无显著影响（图1）。本研究中，0～10 cm 土层中，LN 处理下土壤SOC、TN 和C/N 显著大于CK（表2），且真菌PLFAs 含量和SOC 以及TN 相关性极显著（表3）。研究表明，土壤真菌属于异养型微生物，以土壤有机质作为碳源进行生存和繁殖[29-30]。因此，N 沉降显著增加表层真菌含量（图1）。细菌是土壤微生物中最活跃的组成部分，对有机质分解起重要作用，而且细菌对易利用的碳源（如低分子量、低木质素）响应更加灵敏[18,25,29-30]。相关性分析表明，细菌PLFAs 含量与DOC、SOC 呈显著正相关，表明N 沉降下土壤DOC、SOC 为细菌生物量增加提供了必不可少的营养物质。土壤放线菌能够分解细菌以及真菌难分解的复杂结构化合物[30]，本研究发现，LN 和HN 处理下，0～10 cm土层土壤放线菌含量分别比CK 处理增加26%和15%，表明N 沉降有利于放线菌生物量的增加。有研究表明，放线菌含量和土壤氮的有效性成正相关[31]，通过相关性发现放线菌和土壤TN 的含量成显著正相关，说明N 沉降提高了土壤的TN 含量，进而影响土壤放线菌含量。

N 沉降改变0～10 cm 土层土壤养分的有效性（如DOC、NH4+-N 和NO3--N 含量），进而对0～10 cm 土层微生物生物量和群落结构产生影响。有研究认为，pH 是影响微生物群落结构的关键因素[12-13,18]，虽然本研究中N 沉降改变了土壤pH 值（表2），但相关性表明土壤pH 和各个菌群PLFAs 含量之间相关不显著（表3）。因此，本研究中，土壤pH 值不是导致微生物菌群落结构变化的关键因子。Wan 等[32]对亚热带杉木人工林和米老排人工林研究表明，土壤C/N 是驱动土壤微生物群落结构的关键因子，本研究中，LN 处理显著提高土壤C/N 比（表2），C/N 比增加有利于微生物对土壤养分的吸收[18,30,32]，进而导致土壤微生物群落结构发生改变。此外，土壤微生物群落结构的变化与氮沉降水平有关，研究表明，土壤细菌群落结构对添加N 的响应是非线性的，土壤细菌群落结构的潜在变化发生在氮添加水平为16～32 g·m-2·a-1[33]。本研究中，氮沉降水平分别为40、80 kg·hm-2·a-1，已超过其阈值，这也可能是引起土壤微生物群落结构发生变化的主要原因之一。

5 结论

通过连续4 a N 沉降处理对SOC 和微生物群落结构研究结果表明，LN 处理有利于0～10 cm 土层土壤有机碳的积累，而HN 对SOC 无显著影响；N 沉降主要通过增加土壤DOC、TN、C/N 和各类微生物生物量，加速土壤微生物的周转，进而增加SOC 的积累。此外，N 沉降提高了0～10 cm土壤养分有效性（如DOC 和TN 含量），进而改变了微生物的群落结构。研究结果表明，在短期内（＜ 5 a）的低水平N 沉降有利于亚热带地区常绿阔叶天然林土壤碳的积累。