酿造环境对浓香型白酒香味成分乙酸乙酯的影响

袁 韵，王秀菊，刘石雪，王丽萍，禚林娜，张贵选

(1.山东中科新锐检测检验有限公司，山东临沂 276700；2.山东沂蒙老区酒业有限公司,山东临沂 276700）

酯类是白酒中主要的香味物质，己酸乙酯是浓香型白酒的主体香味物质[1-2]，其含量的占比决定了浓香型白酒的整体品质及风格[3]。优质浓香型原酒乙己比（乙酸乙酯与己酸乙酯含量比值）在0.5 左右，近年来，企业生产的原酒乙酸乙酯含量偏高，不同等级的原酒乙己比甚至大于1，导致原酒香型错位，典型性差[4]。分析影响浓香型原酒中乙酸乙酯含量的因素，并通过主动干预是提高浓香型原酒质量的主要手段[5]。过去对浓香型原酒中乙酸乙酯含量影响的研究通常基于生产工艺、原辅料、窖泥、窖池养护等方面考虑，但未对酿造用水、酒醅、车间内部土壤等酿造环境进行论述。

本研究通过对酿酒车间酿造用水、酒醅、车间内部土壤等酿造环境进行论述，得出酿造环境与浓香型原酒中乙酸乙酯含量的相关性。本研究主要包括3 个方面：不同车间酒醅、窖泥、窖池周围土壤乙酸菌含量对比；不同车间酒醅、酿造用水中金属离子含量对比；不同车间浓香型原酒乙酸乙酯含量对比。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器及试剂

1.1.1 材料

本研究所有样品均由山东沂蒙老区酒业有限公司提供。

1.1.2 试剂及耗材

乙酸乙酯、纯度≥99.7%、阿拉丁试剂(上海)有限公司；水中锰标准溶液、水中镁标准溶液、水中钾标准溶液、水中铁标准溶液、水中铜标准溶液，1000 mg/L，北京坛墨质检科技有限公司；锰标准溶液、镁标准溶液、钾标准溶液、铁标准溶液、铜标准溶液1000 μg/mL、国家有色金属及电子材料分析测试中心；醋酸菌分离培养基[6]，青岛高科园海博生物技术有限公司；去离子水。

1.1.3 仪器与设备

7890B 气相色谱仪、FID 检测器、美国Agilent公司；ICE3500 原子吸收光谱仪、石墨炉/火焰一体机、美国赛默飞；YQX-LS-100A 立式压力蒸汽灭菌器、上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DH6000BⅡ电热恒温培养箱、天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 乙酸乙酯成分含量的测定

色谱条件：CP-Wax 57 CB Acidic 毛细管色谱柱；程序升温：初始温度为35 ℃，保持4 min，以4 ℃/min 升到80 ℃，保持10 min，以8 ℃/min 升到200 ℃，保持10 min；进样口温度250 ℃；检测器温度300 ℃；载气氮气、流速0.8 mL/min、分流比40∶1；进样量1µL。

测定方法：在上述色谱条件下，吸取样品10.0 mL于10 mL 容量瓶中，加内标混匀后进样，根据保留时间及峰面积测定乙酸乙酯含量。每个样品测定两次，取平均值。

1.2.2 金属离子含量测定

Mn2+、Mg2+、K+、Fe3+、Cu2+根据GB 5009.242—2017《食品安全国家标准 食品中锰的测定》、GB 5009.241—2017《食品安全国家标准食品中镁的测定》、GB 5009.91—2017《食品安全国家标准食品中钾、钠的测定》、GB 5009.90—2016《食品安全国家标准食品中铁的测定》、GB 5009.13—2017《食品安全国家标准食品中铜的测定》、GB/T 5750.6—2006《生活饮用水标准检验方法金属指标》分别进行测定。

1.2.3 乙酸菌含量测定

取样方法：窖泥（窖底泥）四角与中心各取10 g；窖壁泥，依据窖壁高度等分为3 段，每段取中心线上3 点窖泥，每点取10 g；将样品混合均匀，分装待测[7]。酒醅：混匀后在酒醅样品堆的10 不同部位各取10 g的样品，将样品混合均匀，分装待测。土样：窖池四周土样地点，每边在3 个不同部位各取10 g的样品，将样品混合均匀，分装待测。

测定方法：根据样品实际状况，将样品依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。取3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种2 个无菌平皿，每皿1 mL。同时取1 mL 生理盐水加入无菌平皿作空白对照。及时将15～20 mL 融化并恒温至46 ℃的醋酸菌分离培养基（含有无水乙醇）倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后。翻转平板，置于30 ℃±1 ℃下培养36 h[8]。选取菌落数在15 CFU～150 CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑醋酸菌群菌落。记录典型菌落形态及特征，选取可疑菌落进行革兰氏染色验证。

2 结果与分析

2.1 乙酸菌含量检测

对4 个酿酒车间指定窖池酒醅、窖泥及周围土壤中乙酸菌含量进行对比，对比结果如表1 所示。并对典型菌落进行菌落形态及染色验证，典型菌落形态及镜检结果见图1。

表1 4个车间酒醅、窖泥及周围土壤中乙酸菌含量(CFU/g)

由表1 可以看出，4 个酿酒车间不同样品乙酸菌含量趋势相同，其含量由低到高顺序为4#＜1#＜2#＜3#。由图1 可以看出，其菌落形态呈圆形、油脂状，表面光滑、凸起，边缘整齐，菌落周围出现白色透明圈；镜下细胞呈短杆状、革兰阴性、无芽胞、有夹馍和鞭毛，证实为乙酸菌。

图1 乙酸菌菌落形态

2.2 金属离子检测

对试验中酒醅样品及酿酒车间酿造用水进行金属离子检测，检测结果见表2。从表2 可看出，车间酒醅及酿造用水中1#及4#的Fe3+含量高于其他两个车间且4#含量大于1#，K+含量由低到高顺序为：4#＜1#＜2#＜3#，Mn2+、Cu2+均未检出。已有研究表明，Fe3+能够促进白酒中乙酸乙酯的降解，加快白酒的老熟[9-11]，降低白酒中乙酸乙酯的含量。

表2 酒醅及酿造用水金属离子含量检测

2.3 乙酸乙酯含量检测

对4 个酿酒车间，每个车间15 个指定窖池浓香型原酒进行乙酸乙酯含量检测，检测结果如表3 所示，各车间浓香型原酒乙酸乙酯含量趋势如图2 所示。从图2 可以看出，4 个酿酒车间浓香型原酒乙酸乙酯含量由低到高的顺序为4#＜1#＜2#＜3#。

图2 各车间浓香型原酒乙酸乙酯含量

表3 不同车间、不同窖池浓香型原酒乙酸乙酯含量(g/L)

3 结论

从结果分析看出，4个车间实验窖池酒醅、窖泥及周围土壤中乙酸菌含量，酒醅及酿造用水中K+含量，与4 个车间浓香型原酒乙酸乙酯含量趋势相同，其含量由低到高的顺序均为4#＜1#＜2#＜3#。酒醅及酿造用水中Fe3+含量，与4 个车间浓香型原酒乙酸乙酯含量趋势相反。

通过对酿酒车间窖泥、酒醅、窖池周围土壤、酿造用水进行乙酸菌及金属离子含量检测，并将结果与不同车间原酒乙酸乙酯含量进行对比，发现酿造环境能够影响浓香型原酒中乙酸乙酯的含量。其环境中乙酸菌、K+含量与浓香型原酒中乙酸乙酯含量成正比关系，Fe3+含量与浓香型原酒中乙酸乙酯含量成反比关系，Mn2+、Mg2+、Cu2+对浓香型原酒中乙酸乙酯含量无明显影响。本相关性结论，旨在对白酒酿造工艺控制起到一个理论性指导。