紫外-可见分光光度计的改造及其在实验教学中的应用

陈玉清，陈双雯，姬媛媛

1厦门大学化学国家级实验教学示范中心，福建 厦门361005

2厦门大学化学化工学院，福建 厦门361005

紫外-可见分光光度计是基于紫外-可见分光光度法原理，利用物质分子对紫外-可见光谱区的辐射吸收来进行分析的一种分析仪器，主要由光源、单色器、吸收池、检测器和信号处理器等部件组成。1918年，美国国家标准局制成了第一台紫外-可见分光光度计。此后，紫外-可见分光光度计经不断改进，又出现自动记录、自动打印、数字显示、微机控制等各种类型的仪器，使分光光度法的灵敏度和准确度也不断提高，应用范围不断扩大。紫外-可见分光光度计在环保、农产品和食品分析、植物生化分析、饲料分析等领域应用广泛[1]。近年来，紫外分光光度计的研究报道依然不少，但主要集中在产品的应用与方法研究[2-14]及检定维护[15-19]等相关方面，使用者对于仪器应用功能的研究报道极为少见，尤其是仪器改造方面。笔者对实验室现有紫外分光光度计进行了简易的改造，拓展了仪器的使用功能，同时，将其与恒流泵和部分收集器联用，组建新蛋白质部分收集系统，并在实验教学中加以应用，提高仪器的使用效率。

1 仪器改造的初衷

笔者所在化学生物学教学实验室属于专业基础实验室，主要承担化学生物学综合实验和生物化学实验。这两门实验课程主要面向化学生物学专业(必修)和学院内其他专业(选修)。蛋白质的分离纯化(含盐析、柱层析等)是生物化学实验的重要内容之一。蛋白质部分收集系统是蛋白质柱层析的主要设备，该系统主要包括部分收集器、核酸蛋白检测仪、恒流泵和记录仪，而相关设备在其他实验项目中鲜有使用。笔者在多年的实验室管理中发现国产的核酸蛋白检测仪和记录仪经常会因为使用频率较低等原因导致实验课中仪器稳定性下降，甚至出现较多的故障。为了解决相关困扰，笔者多年来一直不断探索相关仪器的可替代设备，并最终将目标锁定在分光光度计上。

2 可行性分析

实现分光光度计替代核酸蛋白检测仪和记录仪主要面临两个方面的问题：1) 流动进样；2) 数据的连续采集与记录。笔者实验室现有多种分光光度计(详见表1)，经过综合分析，笔者选用岛津UV-1750作为首选对象。

表1 实验室现有分光光度计统计情况

2.1 硬件可行性分析

分光光度计是教学实验室常见的分析仪器，其数据采集的灵敏度和精度等能够完全满足蛋白质部分收集系统的需要。实验室分光光度计样品室单元通常通过内置比色皿支架与普通比色皿配合使用进行实验样品的分析与测试，不能满足流动样品的在线检测功能，而流动样品的在线检测是蛋白质部分收集系统的必要条件。经调研发现，市场上的微量石英流动比色皿可以很好地解决上述问题。

2.2 软件的可行性分析

岛津UV-1750可以使用专用的PC软件UV Probe，进行数据分析、处理、打印，可显示光谱数据以及时间过程曲线。通过对软件的分析，软件中动力学的时间扫描程序可以实现样品数据的连续采集与记录，进而问题转化为相关参数的设定能否满足实验的需要。经过对采集参数的进一步整理与分析(详见表2)，序号9以前的参数可以满足普通实验教学的需要，序号12以前的参数可以满足多数科研实验的需要。

表2 采集参数分析

3 紫外-可见分光光度计的改造与应用

3.1 仪器的改造与BSA的检测

岛津UV-1750的改造针对样品室单元进行，如图1A所示，采用流动比色皿置于比色皿支架上，流动比色皿上端端口分别连接硅胶管，从样品室底部小孔经仪器底部从左侧或前方出来，一端连接样品，另一端连接收集装置。改造后的岛津UV-1750可替代核酸蛋白检测仪和记录仪应用于传统的蛋白质部分收集系统，组建成新蛋白质部分收集系统，如图1B所示。

3.2 BSA的初步检测

新蛋白质部分收集系统用于牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)初步分析，实验分析条件：层析柱内径16 mm、高400 mm，填料为Sephadex G-100，洗脱液为磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution，PBS)，BSA 浓度 4 mg·mL−1，上样量 1 mL，流速 0.72 mL∙min−1，采集周期 0.7 s，检测波长280 nm，结果如图2所示。从图2可以看出，改造后的UV-1750能够很好地应用于BSA的检测。

图2 BSA的初步分析

3.3 蛋清的分析及新蛋白质部分收集系统在实验教学中的应用

蛋清的处理：取新鲜鸡蛋(4 °C预冷)一个，分离蛋清(后续步骤都在4 °C下进行)，用PBS稀释5倍，静置30 min，离心3220 g (10 min)，收集上清备用。

实验分析条件如3.2节(采样周期调整为0.8 s)，上样分析两次，结果如图3所示。从图3中可以看出，蛋清中蛋白检测情况良好且得到了一定的分离；两次上样分析的结果几乎完全重叠，表明实验重现性良好。复杂生物样品蛋清的分析同时也明确了新蛋白质部分收集系统可以替代传统的蛋白质部分收集系统，应用于实验教学和科学研究的相关实验中。

图3 蛋清的分析

2019年上半年实验室开设的生物化学实验中实验项目“凝胶过滤层析纯化碱性磷酸酶”(碱性磷酸酶为学生从牡蛎中提取的样品)的教学中，部分小组使用了新蛋白质部分收集系统，并取得了预期满意的实验结果。

4 结语

岛津UV-1750的改造，拓展了仪器的使用功能，提高仪器的使用效率，该改造同样适用于岛津UV-1780等系列的相关产品。改造后的设备特别适用于实验室样品分离纯化过程中的在线分析或监测(分光光度法)，同时不影响样品的制备。该改造方法易于操作，理论上适用于实验室常用的大部分分光光度计，易于推广；分光光度计增加流动比色皿都很容易，且多数设备具有数据输出接口，不同设备改造的区别主要在数据采集软件方面，即使没有相关软件或现有软件无法满足要求，通过编程等信息化手段也不难实现。

仪器改造的初衷来源于实验教学，并最终应用于实验教学中。改造后的岛津UV-1750可应用于传统的蛋白质部分收集系统中，解决了核酸蛋白检测仪和记录仪长期在使用中产生的困扰，同时可以减少相关设备的购置，降低实验室设备采购的成本。