亲环蛋白A在口腔鳞状细胞癌组织中的表达及对细胞增殖和侵袭的影响

夏晓杨 方飞 刘燕 车超 柯锦娟 姜胜军

1.湖北省中西医结合医院口腔科，武汉430015；2.武汉大学人民医院口腔科，武汉430060

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcino‐ma，OSCC）作为头颈部常见的恶性肿瘤，病因多样、机制复杂，近年来发病率呈升高趋势[1]。虽然现有的临床治疗手段不断进步，但患者预后依然改善有限，5年总体生存率维持在50%[2]。研究[3]指出，早期淋巴结转移和复发是影响患者预后的主要因素。因此，深入研究影响OSCC转移及复发的相关机制或敏感基因，对指导患者诊疗及改善预后有重要价值。亲环蛋白A（cyclophilin A，Cy‐PA）作为亲环素蛋白家族成员，与细胞装配、折叠、运输及免疫炎症调节等密切相关[4]，其可能发挥癌基因的作用而参与肿瘤发生，与肿瘤细胞转录、凋亡及侵袭转移等密切相关[5]。本研究分析了OSCC 组织中CyPA 蛋白表达，探讨其与临床指标的相关性，以及与OSCC细胞增殖和侵袭的关系。

1 材料和方法

1.1 临床资料

选取湖北省中西医结合医院口腔科2015 年2月—2018 年2 月接受手术治疗且临床资料完整的OSCC 患者77 例，均为原发病例且术前未行放化疗，术后病理学检查证实为OSCC。其中，男性46例，女性31 例，年龄34～76 岁，平均年龄（57.6±11.3）岁。按照第七版美国癌症联合委员会和国际抗癌联盟TNM 分期标准：T1期19 例，T2期23 例，T3期21例，T4期14例；临床分期：Ⅰ期17例，Ⅱ期15例，Ⅲ期27例，Ⅳ期18例；分化程度：中低分化42 例，高分化35 例；发生淋巴结转移36 例。本研究通过医院伦理委员会批准，所有患者均知情同意。

1.2 主要试剂和设备

免疫组化试剂盒及配套试剂（上海碧云天生物技术有限公司），兔抗人CyPA 多克隆抗体（Ab‐cam 公司，美国），SCC-25 细胞系（ATCC 公司，美国），胰蛋白酶、胎牛血清和DMEM 培养液（Gibco 公司，美国），总RNA 提取试剂（Trizol法）、Lipofectamine 2000 转染试剂（Invitrogen 公司，美国），逆转录和聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增试剂（大连宝生物工程有限公司），甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tet‐razolium，MTT）液、二甲基亚砜（dimethyl sulf‐oxide，DMSO）（Sigma 公司，美国），Transwell小室（Corning 公司，美国），实时荧光定量PCR仪（Roche 公司，瑞士），凝胶电泳分析系统（Bio-Rad 公司，美国）。CyPA 干扰序列及阴性对照序列由上海吉玛制药技术有限公司设计合成，CyPA和内参引物由上海生工生物公司设计合成。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化法检测OSCC 和癌旁组织中CyPA蛋白表达 采用免疫组化SP 法，取OSCC 和癌旁组织石蜡标本，连续切片（厚度为4 μm），二甲苯脱蜡至水，PBS 冲洗3 次，加入3%过氧化氢反应15 min，PBS冲洗，置于枸缘酸钠缓冲液中高压高温行抗原修复，PBS 冲洗3 次，加入一抗兔抗人CyPA 多克隆抗体（稀释比例1∶800），4 ℃过夜孵育，PBS 冲洗3 次，加入二抗，室温下培养120 min，PBS冲洗3次，DAB 显色，苏木精复染，脱水、透明、封片、观察。高倍镜下观察，随机取5 个高倍视野，CyPA 蛋白主要表达于细胞浆，根据染色强度和阳性细胞比例判定结果[6]，具体如下。1）染色强度：不着色、淡黄色、棕黄色和黄褐色分别赋予0、1、2 和3 分；2）阳性细胞比例：阳性细胞比例＜5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、＞75%分别赋予0、1、2、3和4分；3）将染色强度和阳性细胞比例得分相加，＜1 分为阴性（-），≥1分为阳性（+）。

1.3.2 细胞培养及分组 用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养SCC-25细胞，培养条件：37 ℃、5%CO2、饱和湿度。待细胞丰度达80%以上时，胰酶消化，传代。按Lipofectamine 2000 转染试剂说明对对数生长期细胞进行分组转染。1）CyPA 干扰序列组：转染CyPA 小分子RNA 干扰（siRNA） 序列5,-GATCCGTGGTGACTTCACACGCCATAATTCAAGAGATTATGGCGTGTGAAGTCACCATTTTTTC-3,；2）阴性对照组：转染阴性对照序列5,-AAGAGAAAAAGCGAAGAGCCA-3,；3）空白组：仅加入无血清培养液。

1.3.3 实时荧光定量PCR 技术检测细胞中CyPA mRNA 表达 转染后，各组培养48 h，加入胰酶及细胞裂解液，Trizol 法提取总RNA，检测总RNA纯度，按逆转录试剂盒说明完成逆转录，使用实时荧光定量PCR 仪对引物体系扩增，CyPA 上游引物序列：5,-CCACCGTGTTCTTCGACATCACG-3,，下游引物序列：5,-GCTCCTCTTGCCATTCCTGACCC-3,；磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde phos‐phate dehydrogenase，GAPDH）上游引物序列：5,-CGTCTTCACCACCATGGAGAAGGC-3,；下游引物序列：5,-AAGGCCATGCCAGTGAGCTTCCC-3,。PCR 条件：94 ℃2 min，94 ℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃30 s，连续循环38次，每个样品设6个复孔。采用2-△△Ct法获得各组细胞中CyPA mRNA 相对表达量[7]。

1.3.4 Western blot 法检测细胞中CyPA 蛋白表达转染后，各组培养48 h，加入胰酶及细胞裂解液，提取总蛋白，按照BCA试剂盒说明检测蛋白浓度。取50 μg 总蛋白行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE），电转至聚偏氟乙烯膜，脱脂奶粉封闭120 min，然后将一抗按1∶1 000稀释后加入，4 ℃过夜孵育，加入二抗，室温反应60 min，加入发光试剂，以GAPDH 为内参获得CyPA蛋白相对表达量。

1.3.5 细胞增殖实验 1）MTT 法：用胰酶对各转染组细胞消化，接种于96孔板，密度为每孔2×104个，继续培养。分别于24、48、72 和96 h 时，向各孔加入MTT 液20 μL，培养5 h，加入DMSO 200 μL，振荡均匀，置酶标仪于490 nm 波长处检测其光密度（optical density，OD）值，用以反映细胞增殖能力[8]。2）平板集落形成实验：取各组转染培养24 h 细胞，胰酶消化，离心重悬，接种于6 孔板，密度为每孔1×103个，尽量让细胞在板底分布均匀，培养箱中培养，出现克隆斑时，弃培养液，PBS 冲洗1 次，甲醛固定，结晶紫染色，晾干、拍照。

1.3.6 细胞侵袭实验 用无血清DMEM培养液稀释Matrigel 基质胶，将稀释液包被Transwell 小室上室。用胰酶对各组转染后48 h 细胞消化，离心，使用无血清培养液重悬（每毫升1×106个），取200 μL 细胞悬液，置于小室上室，将含10%胎牛血清的培养液600 μL 加入下室，恒温培养24 h，取小室，弃培养液，PBS 冲洗3 次，多聚甲醛固定，1%结晶紫染色，用棉签将散落细胞轻轻除去，高倍镜下观察细胞穿膜情况。重复实验3次[9-10]。

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0 软件对实验结果进行分析，计数资料采用率值表示，两组资料间比较使用χ2检验，多组间比较采用单因素方差分析和LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CyPA蛋白在OSCC和癌旁组织中表达

CyPA蛋白在OSCC组织中阳性表达率为76.62%（59/77），癌旁组织中为29.87%（23/77），差异有统计学意义（χ2=33.805，P=0.000）（图1）。

图1 OSCC和癌旁组织中CyPA蛋白的表达 免疫组化染色Fig 1 The expressions of CyPA protein in OSCC and adjacent tissues immunohistochemical staining

2.2 CyPA蛋白在OSCC不同临床指标间表达差异

CyPA 蛋白在不同性别和年龄间的表达差异无统计学意义（P＞0.05），CyPA 蛋白在T3+T4期、Ⅲ+Ⅳ期、中低分化和发生淋巴结转移组织中的阳性表达率升高，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

2.3 3组细胞中CyPA mRNA和蛋白表达

CyPA 干扰序列组、阴性对照组和空白组细胞中CyPA mRNA 相对表达量分别为0.21±0.10、1.03±0.07 和1.02±0.04，差异有统计学意义（F=254.394，P＜0.001）。阴性对照组和空白组细胞中CyPA mRNA 相对表达量差异无统计学意义（P=0.754），CyPA干扰序列组细胞中CyPA mRNA相对表达量低于其他两组（P＜0.05）（图2）。

表1 CyPA蛋白在OSCC不同临床指标间表达差异Tab 1 The differences of the expressions of CyPA protein among different clinical indicators of OSCC

图2 实时荧光定量PCR检测3组细胞中CyPA基因表达Fig 2 Real-time fluorescence quantitative PCR was used to de‐tect the expressions of CyPA gene of cells in three groups

CyPA 干扰序列组、阴性对照组和空白组细胞中CyPA 蛋白相对表达量分别为0.38±0.09、0.76±0.08 和0.86±0.11，差异有统计学意义（F=42.286，P＜0.001）。阴性对照组和空白组细胞中CyPA 蛋白相对表达量差异无统计学意义（P=0.079），CyPA干扰序列组细胞中CyPA 蛋白相对表达量低于阴性对照组和空白组（P＜0.05）（图3）。

图3 Western blot法检测3组细胞中CyPA蛋白表达Fig 3 Western blot was used to detect the expressions of CyPA protein of cells in three groups

2.4 3组细胞增殖能力

MTT 实验结果显示，CyPA 干扰序列组24、48、72和96 h细胞OD值低于阴性对照组和空白组（P＜0.05），阴性对照组和空白组24、48、72和96 h细胞OD 值差异无统计学意义（P=0.582、0.660、0.598、0.226），具体见表2。平板集落形成实验结果显示，CyPA 干扰序列组、阴性对照组和空白组细胞集落数分别为（66.38±4.00）、（174.44±5.82）和（170.30±7.03） 个，差异有统计学意义（F=679.742，P＜0.001），CyPA 干扰序列组细胞集落数低于阴性对照组和空白组，差异有统计学意义（P＜0.05），阴性对照组和空白组细胞集落数差异无统计学意义（P=0.232）（图4）。

表2 3组细胞不同时点增殖能力比较Tab 2 Comparison on the proliferation ability of cells in the three groups at different time points

图4 平板集落形成实验检测3组细胞增殖能力Fig 4 Plate colony formation test was used to detect the proliferation ability of cells in three groups

2.5 3组细胞侵袭能力

Transwell 实验结果显示，CyPA 干扰序列组、阴性对照组和空白组侵袭细胞数分别为（81.14±8.81）、（117.61±5.57）和（122.59±6.27）个，差异有统计学意义（F=62.337，P=0.000），侵袭细胞数在阴性对照组和空白组差异无统计学意义（P=0.238），CyPA 干扰序列组侵袭细胞数低于阴性对照组和空白组（P＜0.05）（图5）。

图5 Transwell实验检测3组细胞侵袭能力 结晶紫 ×200Fig 5 Transwell test was used to detect the invasion ability of cells in 3 groups crystal violet ×200

3 讨论

近年来，OSCC发病率呈升高趋势，由于口腔颌面部机械运动频繁、血流丰富、淋巴结引流广泛，易于肿瘤扩散转移[11]，OSCC 患者早期便可出现转移，已成为影响患者预后的重要危险因素[12]。研究[13]表明，OSCC 转移和侵袭是一个涉及众多基因激活或失活、多步骤、多阶段的演化过程。Cy‐PA 是存在于各类细胞中的亲环素蛋白家族成员[14]，其可能发挥促癌基因功能而参与了多种肿瘤发生进展过程[15]。有研究[16]指出，CyPA 促进了非小细胞肺癌转移。与早期胃癌细胞增殖及移植瘤生长有关[17]。亦有研究[18]指出，CyPA 在口腔黏膜下纤维化表达上调，可能是潜在生物标志物和治疗靶标。但CyPA 在OSCC 组织中表达如何，鲜有报道。本研究中CyPA 蛋白在OSCC 组织中呈高表达，可能发挥癌基因功能促进了OSCC 发生。同时，结果显示，TNM 分期T3+T4期、临床分期Ⅲ+Ⅳ期、中低分化和发生淋巴结转移组织中CyPA 蛋白阳性表达率升高，进一步说明CyPA 蛋白可能参与了OSCC进展及恶性化过程。

本研究中CyPA干扰序列组细胞中CyPA mRNA和蛋白相对表达量明显降低，提示SCC-25 细胞中CyPA mRNA 表达被成功抑制。有研究[19]指出，CyPA 对细胞周期具有调控作用，可通过调控细胞周期而参与细胞增殖及凋亡。本研究结果显示，CyPA 干扰序列组24、48、72 和96 h 细胞OD 值低于阴性对照组和空白组，且细胞集落数减少，这些结果说明抑制SCC-25 细胞中CyPA mRNA 表达水平，可有效抑制细胞增殖能力，提示CyPA 可能参与了SCC-25细胞增殖过程。有研究[20]指出，Cy‐PA 表达上可促进癌细胞迁移。本研究中CyPA 干扰序列组侵袭细胞数低于阴性对照组和空白组，说明下调SCC-25 细胞中CyPA mRNA 表达水平，可抑制细胞侵袭能力，提示CyPA 基因可能参与了SCC-25细胞侵袭过程。

综上所述，CyPA 蛋白在OSCC 组织中呈高表达，与肿瘤发生和进展密切相关，下调SCC-25 细胞中CyPA 基因表达，可抑制细胞增殖和侵袭能力，为开展机制研究及基因靶向治疗提供新的方向。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。