抗生素对刺芹侧耳菌丝生长的影响

姜 宁 李正鹏 周 峰 董浩然 李巧珍 李 玉

(上海市农业科学院食用菌研究所，农业农村部南方食用菌资源利用重点实验室，国家食用菌工程技术研究中心，国家食用菌加工技术研发分中心，农业农村部应用真菌资源与利用重点开放实验室，上海市农业遗传育种重点开放实验室，上海 201403)

刺芹侧耳（Pleurotnseryngii）俗称杏鲍菇，隶属于真菌界、担子菌门、伞菌纲、蘑菇目、侧耳科、侧耳属[1]，是目前国内进行规模化生产的主要食用菌之一。同时，刺芹侧耳菌肉肥厚，质地脆嫩，菌柄脆滑，味道鲜美，有淡淡的杏仁香味和肥嫩的鲍鱼口感，因而被称为“平菇王”“干贝菇”“草原的美味牛肝菌”[2]。此外，刺芹侧耳营养丰富，富含多种氨基酸、多糖和寡糖，具有防癌抗癌、降血脂、降胆固醇以及提高人体免疫力等功效。

近年来，食用菌的遗传转化及功能研究成为了热点，常用的遗传转化方法有PEG介导转化法[3]、限制性内切酶介导的DNA转化法[4]、基因枪转化法[5]、电激转化法[6]、根癌农杆菌介导的遗传转化法等。其中，根癌农杆菌介导的遗传转化法是一种天然的转化载体系统，具有操作方便、不需要复杂的仪器设备、转化成本低且转化效率高、容易获得单拷贝的转化菌株、重复性较高、在食用菌转化的受体选择上具有灵活性等优点[7-8]，故近年来该遗传转化法在双孢蘑菇[9]、糙皮侧耳[10]、香菇[11]、金针菇[12]、刺芹侧耳[13]等食用菌中已取得了一定的研究成果。但在根癌农杆菌介导的刺芹侧耳的遗传转化研究中，转化受体对于卡那霉素、氨苄青霉素、头孢噻肟钠、潮霉素等抗生素的敏感性是运用该技术的关键，而且选择合适的筛选标记基因以及抗生素浓度对提高转化效率都具有很大的影响。在此背景下，笔者拟在根癌农杆菌介导的刺芹侧耳的遗传转化研究中，对常用抗生素对刺芹侧耳菌丝生长的影响进行研究和探索，以期为进一步建立并优化根癌农杆菌介导的刺芹侧耳的遗传转化体系提供理论基础。现将相关试验结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 供试菌株和试剂

供试菌株为刺芹侧耳“国森一号”菌丝体，保藏于上海市农业科学院食用菌研究所。供试抗生素为卡那霉素、氨苄青霉素、头孢噻肟钠、潮霉素，均购于生工生物工程(上海)股份有限公司。供试马铃薯葡萄糖琼脂购于碧迪医疗器械（上海）有限公司。

1.2 培养基配制

将马铃薯葡萄糖琼脂称取39 g溶于1 L蒸馏水中，彻底混匀，用玻璃棒快速搅拌加热3 min，待粉末完全溶解后，用500 mL三角瓶分装，在121 ℃的高温高压下灭菌20 min，冷却至40～45 ℃，加入不同浓度的抗生素，充分混匀后倒入培养皿中，待培养基凝固后进行接种。

培养皿中抗生素的终浓度分别为：卡那霉素0、25、50、75、100、125 mg/L，氨苄青霉素 0、25、50、75、100、125 mg/L，头孢噻肟钠0、100、200、300、400、500 mg/L，潮霉素0、10、20、30、40、50 mg/L。

1.3 菌种活化培养与接种

将液氮中保藏的刺芹侧耳“国森1号”菌种转接到PDA培养皿中进行活化培养，待菌丝长满平板时用打孔器打孔，将打孔菌块分别接种到含有4种抗生素不同浓度的培养皿中，并用封口膜封口，然后将其置于25 ℃培养房中进行恒温培养。每种抗生素、每个浓度梯度接种3组作为平行对照。

1.4 测定项目

观察记录不同种类、不同浓度下抗生素培养皿中的刺芹侧耳菌落形态、菌丝生长速率、抗生素对菌丝生长的抑制率。即在刺芹侧耳菌丝培养10 d时，观察记录培养皿中刺芹侧耳菌丝的生长状态，测量计算每个培养皿中刺芹侧耳菌丝生长速率和抗生素对菌丝生长的抑制率。计算公式为：菌丝生长速率（mm/d）=菌丝生长长度÷菌丝培养天数；抗生素对菌丝生长的抑制率（%）=(对照菌丝生长速率-抗生素处理菌丝生长速率) ÷对照菌丝生长速率。

2 结果与分析

2.1 卡那霉素对刺芹侧耳菌丝生长的影响

经试验期间观察，刺芹侧耳菌丝在含有卡那霉素抗生素的培养皿中生长正常，菌丝洁白均匀，长势旺盛，与对照培养皿中的菌丝生长状况无明显差异。由表1可知，刺芹侧耳菌丝生长速度随着卡那霉素浓度的升高而降低；卡那霉素对刺芹侧耳菌丝生长具有轻微的抑制作用，但仅在浓度为125 mg/L时，卡那霉素对菌丝生长的抑制率高于10%。因此，卡那霉素不适合作为刺芹侧耳遗传转化的筛选抗生素进行使用。

表1 卡那霉素对刺芹侧耳菌丝生长的影响

2.2 氨苄青霉素对刺芹侧耳菌丝生长的影响

经试验期间观察，刺芹侧耳菌丝在含有氨苄青霉素抗生素培养皿中生长正常，菌丝厚实健壮，洁白浓密，平滑均匀，与对照培养皿中的菌丝生长状况无明显差异。由表2可知，低浓度的氨苄青霉素可以促进刺芹侧耳菌丝生长，虽然随着氨苄青霉素浓度的升高，对刺芹侧耳菌丝生长的抑制率也随之增加（浓度为50 ml/L除外），但是氨苄青霉素并不会抑制刺芹侧耳菌丝生长。因此，氨苄青霉素不适合作为刺芹侧耳遗传转化的筛选抗生素进行使用，但可用作根癌农杆菌侵染刺芹侧耳菌丝受体后抑制根癌农杆菌生长的抗生素，其在抑制根癌农杆菌生长的同时不会影响刺芹侧耳菌丝的生长。

表2 氨苄青霉素对刺芹侧耳菌丝生长的影响

2.3 头孢噻肟钠对刺芹侧耳菌丝生长的影响

由表3可知，头孢噻肟钠对刺芹侧耳菌丝生长没有明显的抑制效果，且经试验期间观察，在含有不同浓度头孢噻肟钠抗生素的培养皿中，刺芹侧耳菌丝都能正常生长，菌落形态规则、齐整，与对照培养皿中的菌丝生长状况无明显差异。因此，头孢噻肟钠可用作根癌农杆菌侵染刺芹侧耳菌丝受体后抑制根癌农杆菌生长的抗生素，其在抑制根癌农杆菌生长的同时不会影响刺芹侧耳菌丝的生长。

表3 头孢噻肟钠对刺芹侧耳菌丝生长的影响

2.4 潮霉素对刺芹侧耳菌丝生长的影响

由表4可知，浓度为10 mg/L的潮霉素已经对刺芹侧耳菌丝生长有明显的抑制效果，当浓度达到40 mg/L时，潮霉素对刺芹侧耳菌丝生长的抑制率达96.95%，当浓度达到50 mg/L时，刺芹侧耳菌丝无法生长，被完全抑制。同时，经试验期间观察，在含有不同浓度潮霉素的抗生素培养皿中，刺芹侧耳的接种菌块颜色变深、发黑，菌丝发黄发黑、稀疏细弱，无法正常生长。因此，潮霉素可用作刺芹侧耳遗传转化的筛选抗生素。

表4 潮霉素对刺芹侧耳菌丝生长的影响

3 小结与讨论

筛选标记基因是一种已知序列或已知功能的基因，在遗传转化中担负着区分转化子和非转化子的重要作用。在筛选压力下，不含标记基因及其产物的非转化子死亡，而转化子由于具有抗性，可以继续存活，因而有利于区分转化子和非转化子[14]。因此，合适的筛选标记基因及其相应的筛选剂是生物体遗传转化成功的关键。

卡那霉素是遗传转化研究中被广泛应用的抗生素筛选剂。本研究发现，在卡那霉素不同试验浓度下，刺芹侧耳菌丝生长正常，表明卡那霉素对刺芹侧耳菌丝生长没有显著的抑制效果，不能达到区分转化子和非转化子的目的。因此，卡那霉素不适合作为刺芹侧耳遗传转化的筛选抗生素进行使用。

潮霉素是植物中应用较广泛的筛选抗生素，其作用机理是潮霉素可以稳定核糖体大亚基上的tRNA结合位点，导致空载tRNA不能脱离核糖体，进而影响细胞蛋白质的翻译，从而抑制植物细胞的形成和生长[15]。本研究发现，刺芹侧耳菌丝对潮霉素异常敏感，浓度为50 mg/L的潮霉素即能完全抑制菌丝生长，而携带潮霉素抗性基因hpt的载体可编码一种潮霉素磷酸转移酶，这种酶可使潮霉素发生磷酸化而失活，从而使转化子不受潮霉素的毒害作用，最终达到筛选目的[16]。因此，潮霉素可以作为刺芹侧耳遗传转化的筛选抗生素进行使用。

在食用菌的遗传转化试验中，携带载体的根癌农杆菌侵染完成后需清除多余的根癌农杆菌，避免影响受体菌丝的正常生长。而氨苄青霉素和头孢噻肟钠均可抑制根癌农杆菌的生长，且在本研究中发现，在不同试验浓度下，氨苄青霉素和头孢噻肟钠均对刺芹侧耳菌丝生长没有抑制效果，在一定浓度下反而能促进菌丝生长。因此，在刺芹侧耳遗传转化研究中，可选择氨苄青霉素和头孢噻肟钠用于抑制根癌农杆菌生长。