活血潜阳祛痰方对肥胖高血压大鼠心肌氧化应激及炎症的影响*

芦 波 谢 君 符德玉 陈晓喆 赵铭一 桂明泰 周训杰 姚 磊 李建华

（上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海 200437）

近年来，肥胖和严重肥胖的患病率持续增长，2017年至2018年成人肥胖率为42.4%［1］，我国肥胖人数高居全球第一［2］，与此同时，高血压的流行程度也与日俱增［3］。肥胖是心血管疾病的独立危险因素，可加剧高血压靶器官损害及其心血管并发症的病理进程，肥胖高血压（OBH）相关的心肌重构是亟待解决的卫生问题。本研究观察活血潜阳祛痰方对OBH大鼠心肌重构的影响，并初步探讨该方药治疗OBH的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

5周龄SPF级雄性SHR78只，实验动物合格证号：1100111911038390，雄性WKY6只，实验动物合格证号：1100111911038391，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK（京）2016-0006。

1.2 实验药物

活血潜阳祛痰方由丹参、石决明、川芎、钩藤、桑寄生、山楂和玉米须组成。按照课题组前期研究，大鼠用量为临床用量的18倍，委托南京军区总医院药剂科制备浸膏备用，生药浓度5.98 g/mg。缬沙坦，由诺华制药公司（北京）生产，产品批号：X2637。

1.3 试剂与仪器

1）试剂：MDA（货号：A003-1-2）和Mn-SOD生化试剂盒（货号：A001-2-2）均由南京建成生物工程研究所提供。AngⅡ酶联免疫试剂盒，上海信裕生物科技有限公司，货号：xy-E12947；NOX4抗体，abcam公司，货号：ab133303；NF-κb p65抗体，abcam公司，货号：ab16502；ERK1/2抗体，CST公司，货号：4695T；p-ERK1/2抗体，CST公司，货号：4370T。2）仪器：BIORAD公司电泳仪（型号mini protean 3 cell），大连竞迈科技有限公司电转仪（PS-9），Tanon-5200成像系统，多功能酶标仪（Bio Tek），台式高速冷冻离心机（Eppen⁃dorf），芬兰雷勃MK3型酶标仪，吉尔森Pipetman型移液器，LeicaHI1210型水浴锅，美国Revco ULT2586-4-V型超低温冰箱，美国Baker SG403TX/603TX型生物安全柜，德国Leica正置显微镜（DM2000），超声诊断仪（Super Sonic Aixplorer）。

1.4 模型制备

适应性喂养1周后，根据SHR体质量随机筛选出6只继续喂养普通饲料（SHR组），余喂养高脂饲料（配方参考文献［4］改进：普通繁殖饲料60%，猪油12.5%，蔗糖10%，蛋黄粉10%，奶粉5%，胆固醇2%，胆盐0.5%；委托江苏美迪森生物医药有限公司制作）。10周后，将高脂饲料喂养的SHR中体质量位于上游前1/3的大鼠（n=24）选为OBH大鼠［5］。

1.5 分组与给药

24只OBH大鼠随机分为4组，每组6只，药物干预10周。WKY组予普通饲料+饮用水灌胃；OBH组予高脂饲料+饮用水灌胃；中药低剂量组予高脂饲料+中药19.35 g/（kg·d）灌胃；中药高剂量组予高脂饲料+中药38.7 g/（kg·d）灌胃；缬沙坦组予高脂饲料+30 mg/（kg·d）缬沙坦灌胃；SHR组予普通饲料+饮用水灌胃。

1.6 观察指标

1.6.1 心脏超声 给药结束后大鼠行脱毛处理，异氟烷吸入麻醉，采用高分辨率小动物超声仪检查心脏超声：左心室舒张末期内径（LVIDd）、室间隔厚度（IVSd）、左心室后壁厚度（LVPWd），每只大鼠取3个心动周期进行测量，取平均值，自动计算LVM-cor。每组检测3只。

1.6.2 血液标本取材 给药结束后大鼠禁食不禁水12 h后取材。称重并记录其体质量（BW），2%的戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射后固定，胸腹部脱毛，75%酒精消毒皮肤，暴露腹腔，以一次性采血针腹主动脉取血8～10 mL，离心，吸取上层血清，分装置于-80℃冰箱中保存备用。

1.6.3 心脏重构指标检测 腹主动脉取血后，迅速开胸取出心脏，用预冷的生理盐水冲洗干净残余血液，滤纸吸干水分后，用微型电子天平称取心脏质量（HW）和左心室质量（LVM），心脏质量指数=HW/BW和左室质量指数（LVMI）=LVM/BW。

1.6.4 心肌组织病理观察 取心尖部组织固定在10%甲醛溶液中，经石蜡包埋后制成厚度约4 μm的切片，进行HE染色，在光学显微镜下观察。

1.6.5 血清和心肌AngⅡ检测 按上海信裕生物科技有限公司提供的试剂盒说明书检测血清和心肌AngⅡ水平。

1.6.6 心肌Mn-SOD和MDA检测 按试剂盒说明书测定心肌组织中Mn-SOD和MDA含量。

1.6.7 Western blotting检测 每100 mg心肌组织置于培养皿中，手术剪剪碎成4 mm×4 mm左右的小块，加入冷裂解液0.5～1 mL，玻璃匀浆器上下手动匀浆，匀浆液在4℃，以3 000 r/min离心5 min，取上清转移测蛋白浓度；GAPDH作为内参，取待测蛋白样品经SDSPAGE电泳，转移至NC膜上，将NC膜放入平皿中，加入含5%脱脂奶粉的封闭液，洗膜3次。放入含NOX4、NF-κB p65、ERK1/2、p-ERK1/2一抗的平皿中，4℃摇床振荡孵育过夜。吸弃一抗，用5%脱脂奶粉封闭液稀释半抗兔HRP标记二抗，室温摇床振荡反应1～2 h。洗膜后显影、定像。使用软件对结果进行灰度分析。

1.7 统计学处理

应用SPSS24.0统计软件。计量资料符合正态分布及方差齐性时以（±s）表示，多样本均数比较采用One-Way ANOVA及SNK多重比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠心肌HE染色结果

见图1。WKY组心肌细胞体积正常，排列整齐，心肌各层均匀，结构清晰；SHR组心肌细胞肿胀变性，心肌纤维排列紊乱，心肌成纤维细胞增殖（见箭头）；OBH组心肌细胞变性，心肌纤维排列紊乱成波浪状（见箭头），核固缩，成纤维细胞增殖明显；中药低剂量组心肌轻度水肿，心肌纤维排列紊乱，或见个别成纤维细胞浸润；中药高剂量组心肌轻度水肿，细胞核形态趋于正常的圆形或椭圆形，心肌纤维排列趋于整齐，或见个别成纤维细胞浸润；缬沙坦组心肌细胞轻度变性，心肌纤维轻度波浪状。

图1 各组大鼠心肌细胞形态观察（HE染色，200倍）

2.2 各组大鼠心脏重构指标比较

见表1。结果显示OBH组心脏质量指数高于WKY组（P＜0.05），中药高剂量组和缬沙坦组均可显著降低大鼠心脏质量指数（P＜0.05）；OBH组LVMI高于SHR组和WKY组（P＜0.05），中药低剂量组、中药高剂量组和缬沙坦组均可显著降低大鼠LVMI（P＜0.05），中药低剂量组和中药高剂量组比较差异无统计学意义。

表1 各组大鼠心脏重构指标比较（±s）

表1 各组大鼠心脏重构指标比较（±s）

注：与WKY组比较，*P＜0.05；与SHR组比较，#P＜0.05；与OBH组比较，◇P＜0.05；与中药低剂量组比较，※P＜0.05；与中药高剂量组比较，△P＜0.05。下同。

LVMI（mg/g）2.60±0.13 2.99±0.15*3.26±0.27*#2.91±0.08*◇2.71±0.12#◇2.46±0.13#◇※组别WKY组SHR组OBH组中药低剂量组中药高剂量组缬沙坦组n 6 6 6 6 6 6心脏质量指数（mg/g）3.23±0.21 3.72±0.22*3.69±0.22*3.49±0.12*#3.25±0.11#◇※3.09±0.13#◇※

2.3 各组大鼠心脏超声指标比较

见表2。结果显示OBH组LVM-cor高于WKY组（P＜0.05），中药高剂量组和缬沙坦组均可降低LVM-cor（P＜0.05）；各组间LVIDd、IVSd、LVPWd比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组大鼠心脏超声指标比较（±s）

表2 各组大鼠心脏超声指标比较（±s）

组别WKY组SHR组OBH组中药低剂量组中药高剂量组缬沙坦组n 3 3 3 3 3 3 LVM-cor（mg）832.91±100.00 983.07±72.56 1 129.66±50.28*1 044.93±149.78*952.93±28.70◇923.73±101.16◇LVIDd（mm）7.01±1.01 7.38±0.84 7.40±0.78 6.86±0.83 7.18±0.64 7.19±0.23 IVSd（mm）2.12±0.25 2.17±0.18 2.59±0.22 2.54±0.45 2.20±0.28 2.13±0.21 LVPWd（mm）1.90±0.49 2.08±0.45 2.06±0.29 2.21±0.55 2.07±0.05 2.03±0.18

2.4 各组大鼠血清和心肌AngⅡ水平比较

见表3。结果显示OBH组血清AngⅡ高于SHR组和WKY组（P＜0.05），中药低剂量组、中药高剂量组和缬沙坦组均可下降血清AngⅡ（P＜0.05），缬沙坦组优于中药高剂量组，中药高剂量组优于中药低剂量组；OBH组心肌AngⅡ高于SHR组和WKY组（P＜0.05），中药低剂量组、中药高剂量组和缬沙坦组均可下降心肌AngⅡ（P＜0.05），但3个用药组组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组大鼠AngⅡ、MDA、Mn-SOD水平比较（±s）

表3 各组大鼠AngⅡ、MDA、Mn-SOD水平比较（±s）

组别WKY组SHR组OBH组中药低剂量组中药高剂量组缬沙坦组n 6 6 6 6 6 6血清AngⅡ（pg/mL）257.89±55.38 598.66±678.54*678.54±106.31*#565.00±122.87*◇445.61±75.32*#◇※352.73±62.14*#◇※△心肌AngⅡ（μg/g）34.57±14.59 82.34±17.57*104.82±27.73*#73.70±23.90*◇64.04±20.56*◇56.30±23.07*#◇心肌 MDA（nmol/mg）3.32±0.81 6.47±0.79*7.68±0.41*5.12±0.25*#◇4.85±0.58*#◇4.74±0.45*#◇心肌 Mn-SOD（U/mg）52.23±7.58 18.39±3.56*14.66±4.13*34.26±7.02*#◇38.57±6.65*#◇39.17±7.15*#◇

2.5 各组大鼠心肌氧化应激指标比较

见表3。结果显示OBH组心肌MDA水平高于WKY组（P＜0.05），中药低剂量组、中药高剂量组和缬沙坦组均可降低MDA（P＜0.05），3个用药组组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）；OBH组心肌Mn-SOD水平低于WKY组（P＜0.05），中药低剂量组、中药高剂量组和缬沙坦组均可升高心肌Mn-SOD（P＜0.05），3个用药组组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.6 各组大鼠心肌NOX4、NF-κB p65蛋白水平和ERK1/2磷酸化比值比较

见表4，图2。结果显示OBH组NOX4水平高于WKY组（P＜0.05），中药低剂量组、中药高剂量组和缬沙坦组均可降低NOX4水平（P＜0.05），3个用药组组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）；OBH组NF-κB p65表达高于SHR组和WKY组（P＜0.05），中药低剂量组、中药高剂量组和缬沙坦组均可降低NF-κB p65水平（P＜0.05），3个用药组组间比较差异无统计学意义；OBH组ERK1/2磷酸化比值高于SHR组和WKY组（P＜0.05），中药低剂量组、中药高剂量组和缬沙坦组均可降低心肌ERK1/2磷酸化比值（P＜0.05），3个用药组组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表4 各组心肌NOX4、NF-κB p65蛋白水平和ERK1/2磷酸化比值比较（±s）

表4 各组心肌NOX4、NF-κB p65蛋白水平和ERK1/2磷酸化比值比较（±s）

组别WKY组SHR组OBH组中药低剂量组中药高剂量组缬沙坦组n 6 6 6 6 6 6 NOX4 0.25±0.08 0.73±0.25*1.06±0.30*0.65±0.17*◇0.63±0.22*◇0.51±0.33◇NF-κB p65 0.23±0.03 0.68±0.16*0.98±0.17*#0.64±0.04*◇0.69±0.08*◇0.55±0.12*◇ERK1/2磷酸化比值0.92±0.14 1.71±0.39*2.42±0.63*#1.80±0.21*◇1.40±0.20◇1.35±0.56◇

图2 各组大鼠心肌NOX4、NF-κB p65、ERK1/2蛋白表达水平

3 讨 论

我国高血压患病率高达29.6%，患者已达3亿［4］。左室肥厚（LVH）是高血压常见的靶器官损害，也是心脏病发病率和死亡率增加的独立危险因素。高血压和肥胖分别占LVH病因的25%和14%，二者合并存在则高达52%［6］，不容忽视。

中医将OBH多归于“眩晕”等范畴，属本虚标实之证。OBH者多恣食肥甘厚味，肝气易动，脾失健运，痰浊内蕴，阻塞脉道，血运失畅，瘀血渐生，痰瘀阻滞，损伤心脉，可致心肌重构。活血潜阳祛痰方是基于“阳亢、血瘀、痰浊”的组方，课题组既往发现，该方既能降压，又可降低OBH大鼠的Lee's指数，为缓解LVH奠定了基础［7］。OBH大鼠心肌细胞变性明显，心肌纤维排列紊乱成波浪状，核固缩，成纤维细胞增殖明显，心脏质量指数、LVMI和LVM-cor均显著升高（P＜0.05），具有明显的LVH。中药能显著降低LVMI，中药高剂量组心脏质量指数、LVM-cor值、血清和心肌AngⅡ水平显著降低（P＜0.05），疗效优于中药低剂量组。

NOX4是心脏活性氧（ROS）的主要来源［8］，参与了压力和容量负荷增加引起的心肌肥厚［9］和AngⅡ诱导的心肌肥大［10］。过表达NOX4或AngⅡ诱导心肌内源性NOX4增加，可诱导心脏纤维化和心肌细胞凋亡［11］。奥美沙坦酯可抑制NOX4基因表达和ROS的产生，发挥了改善心肌纤维化和心肌重构的作用，且该作用独立于其降压作用［12］。本研究发现OBH组心肌有明显的氧化应激失衡，其Mn-SOD水平降低，而MDA和NOX4表达水平升高。活血潜阳祛痰方可降低MDA和NOX4表达（P＜0.05），提高Mn-SOD水平（P＜0.05）。可见调控氧化应激稳态可能是活血潜阳祛痰方改善心肌重构的机制之一。

过表达NOX4和/或外源性AngⅡ输注均可激活心肌NF-κB信号通路［11］。NF-κB激活后可移位到核内，促进相关炎性因子的释放，导致心肌成纤维细胞（CF）的增殖，参与心肌肥厚［13］。ERK1/2是丝裂原活化蛋白激酶家族中的一个重要亚族，可调节细胞增殖。活化的ERK1/2通过级联反应激活NF-κB使其磷酸化，诱导炎症反应，促进糖尿病和高血压心肌中胶原沉积［14-15］。体外实验发现，AngⅡ可激活CF中的ERK1/2和NF-κB［16］，参与了胶原积聚和纤维化。ERK1/2敲除可以逆转主动脉结扎小鼠的高血压性心肌肥厚［17］，抑制ERK1/2也能阻断内皮素-1诱导的SHR心肌细胞的肥大［18］。因此，下调ERK1/2—NF-κB信号通路可能是改善心肌重构的靶点。活血潜阳祛痰方能下调OBH心肌中ERK1/2和NF-κB的激活来改善心肌肥厚，炎症反应可能是OBH心肌重构的重要环节。

综上可见，氧化应激和炎症反应交互作用参与了OBH心肌重构，二者间作用错综复杂，具体机制有待进一步研究。活血潜阳祛痰方可改善OBH大鼠心肌肥厚，具有靶器官保护作用，调控氧化应激和炎症反应是其可能作用机制。