动物血清中四环素类残留的快速检测——放射免疫法

王 楠，苏明明，张晓声，沈伟健，陈 静

（大连海关技术中心，辽宁大连 116000）

四环素是四环素族抗生素中最基本的化合物，分子式为C22H24N2O8，本身及其盐类都是黄色或淡黄色的晶体，在干燥状态下稳定性极高，除金霉素外,其他的四环素族的水溶液都相当稳定。四环素族除可溶于低浓度的酸碱溶液，也可以微溶于水、甲醇、乙醇等溶液，但不溶于醚类溶液，如石油醚等[1～2]。四环素族抗生素主要包括金霉素、土霉素、四环素。四环素类抗生素在20 世纪中叶时期被科学家发现，属于广谱抗生素，广泛应用于革兰氏细菌和细胞支原体引起的细菌感染[3～5]。目前，四环素作为生长促进剂在畜牧业发展中发挥了重要的作用，并且可以预防和治疗动物养殖过程中产生的多种感染性疾病[6～7]。然而，在动物屠宰之前，动物体内的四环素不能完全代谢掉，有很大一部分残留下来，并主要集中在肝脏和肾脏部位[8～10]。人们在食用了有四环素类抗生素残留的动物源食品，会对身体造成严重的伤害，引起较多严重疾病，比如肝肾中毒，影响中枢神经系统以及血液系统的疾病等。如果长期食用，不仅会产生耐药菌株，还会产生过敏反应，降低对病菌的免疫能力[11]。我国2020年4月实施的GB 31650-2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》以及一些欧美等国家，都对食品中四环素类药物残留量做了严格的规定：土霉素、四环素、金霉素最低值都不得超过100 μg/kg。

目前，四环素类药物检测方法有许多种，主要有微生物检测法、高效液相色谱法（HPLC）和酶联免疫吸附法（ELISA）等。其中，微生物检测法耗时较长，且容易被其他抗生素类干扰，检测准确度不足。高效液相色谱法是目前常用的可以对大批量样品进行检测的方法，检测灵敏度和准确度较高，但是前处理方法复杂费时，且成本较高，不适合快速检测。酶联免疫吸附法容易产生交互反应，且需要对每一种抗体进行分别标记，导致检测费用较高，且无法解决同时检测四环素类药物多残留的问题[12～13]。Charm Ⅱ放射免疫分析法具有样品前处理简单快速、特异性强、检测时间短等优点，可以检测四环素类药物残留总量，并且具有高效液相色谱法检测的准确性和免疫吸附法检测的高效性，适用于初筛检测。该检测方法也已经得到了美国FDA和欧盟等国家的认可和应用，具有广阔的应用前景。

1 材料和方法

1.1 设备和材料

Charm Ⅱ7600 分析仪（美国Charm 公司）；高速冷冻离心机；涡旋震荡器；恒温培养箱（80±2℃）；闪烁液加液器；离心管；硼硅玻璃试管及试管塞；液体闪烁计数器（美国Charm 公司）；药片压杆。

1.2 样品和试剂

检测基质为羊和鸡的血清：分别采集两种动物血液，将采集好的血液置于容器内，室温下静置10 h，等待其析出血清，并收集血清备用。检测试剂为四环素类Charm Ⅱ检测试剂盒、闪烁液、阴性对照液、多抗标准品等

1.3 实验方法

1.3.1 实验原理

微生物细胞表面存在着不同的特异性点位，并能够与各种四环素类药物共有功能基团相结合发生相应的微生物受体反应。检测四环素类药物残留时，同时加入微生物受体结合物和[3H]标记过的金霉素。如果样品中存在四环素类药物残留，就会同[3H]标记过的金霉素竞争结合微生物受体结合物的相关点位。用液体闪烁计数仪测定样品反应后的[3H]含量的cpm 值（即每分钟脉冲数），cpm 值越低，则四环素类药物残留量越高。

1.3.2 样品制备

在50 ml 离心管中加入1 ml 血液样品和30 ml MSU 提取缓冲溶液，涡旋振荡5 min。将离心管于（80±2）℃的恒温培养箱中放置45 min，取出后置于冷水中10 min，1750 g 离心10 min，取上清液备用。恢复室温后，测定其pH 值是否为7.5，如不准确则使用试剂盒配置的M2 缓冲液或1 mol/L盐酸调节pH 值为7.5，即为样品测试液。

1.3.3 测定步骤

用药片压杆的平端将白色药片压入已加入300 μl 蒸馏水的玻璃试管内，涡旋振荡10 s 直至药片破碎。吸取4 ml 处理好的血液试样放入试管中，压入橙色药片，用振荡器上振荡15 s，使样品上下15 次，置于（65±1）℃的恒温培养箱中3 min，取出后1750 g 离心5 min，离心停止后立即取出试管，倒掉上清液（此时不宜太用力，防止将有四环素标记的药物甩出，造成结果不准确），用棉签清理试管壁内的残渍，注意不可触碰沉淀物。向试管中加入300 μl 蒸馏水，摇动试管直至沉淀物完全破碎，之后加入3 ml 闪烁液，涡旋混匀至试管无不均一的云状物，放置1 min 后，将试管放入Charm Ⅱ7600 分析仪中，读取[3H]的cpm 值。

1.3.4 控制点的建立

选取六份已知不含四环素类药物残留的血清样品，按照试剂盒使用说明书的要求加入不同浓度的抗生素，按照上述测定步骤进行测定，得到6 次计数值，计算平均值，则可计算出控制点为：平均值×（1+20%）。

1.3.5 结果判定

当样品计数值大于控制点时，则判定为阴性样品。当样品计数值小于等于控制点时，在初筛时判定为疑似阳性，此时应对样品进行复检，同时增加一个阴性对照和阳性对照，判断使用的检测试剂是否失效，以及检测的仪器是否出现问题。判定样品为阳性有两个要求：一是阴性对照的范围内波动不可以超过阴性对照平均值的80%～120%；二是阳性对照的计数值必须要小于控制点。如果可以同时满足以上两点，并且重新测试的样品计数值也小于控制点，则可以判定为阳性样品。

2 结果与分析

2.1 抗原抗体的竞争性

在Charm Ⅱ放射免疫分析中的受体和[3H]标记的金霉素抗原的量是固定的，因此可以通过对不同药物浓度检测来确定方法的灵敏度。以MSU 萃取缓冲液为零标准，将MSU 多种抗生素标准品依次配制成10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0、1000.0 µg/kg 标准溶液，并分别测定cpm 值，表1结果显示，测定的cpm 值与添加的药物浓度呈反比，当到达一定浓度后cpm 值将不再变化。

表1 不同药物浓度测定结果

2.2 检出限以及线性范围的确定

在已知阴性的基质中添加不同浓度的MSU 多种抗生素标准品进行测试，以确定基质的检测限。分别向羊血清和鸡血清中添加浓度分别为0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 μg/kg 的四环素测试，得到结果见表2。

表2 不同基质中不同添加水平的测定结果

以添加水平的自然对数ln(ρ)为自变量，分别对相应质量浓度的羊血清和鸡血清的cpm 数值相对值（即相应浓度cpm 值与阴性控制cpm 值的比值，B/B0）进行线性拟合，得到结果见图1～2。

图1 羊血清ln(ρ)与B/B0 值拟合曲线

图2 鸡血清ln(ρ)与B/B0 值拟合曲线

各数据点都较好地分布在拟合曲线两侧，拟合情况良好，各种基质中ln(ρ)均与cpm 值存在着良好的线性关系。根据实际情况确定检测限时，考虑到分析相对标准偏差，一般要测定两项内容，分别是样品空白加标与空白样品，测定的cpm 值相对值应该小于0.6，确定金霉素在动物血清中的最低浓度应不小于20 μg/kg。

3 结论

Charm Ⅱ检测方法不仅符合国内四环素快速检测要求，同时也是其他国家采用的快速检测手段，符合国际标准。使用Charm Ⅱ放射免疫分析法检测动物血清中四环素类药物残留，可以提高检测效率，降低检测成本，适用于对大量活体动物体内四环素检测的阳性初筛，具有检测灵敏度高、稳定性良好、特异性强、准确度高等优点，是一种快速有效的检测动物体内四环素类药物残留的筛选方法。