UV-B 辐射增强对元阳梯田地方水稻叶片氮代谢及产量的影响*

谢春梅，李 想，盛建军，张彦雪，何永美，李 元，祖艳群

(1.云南农业大学 资源与环境学院，云南 昆明 650201；2.云南农业大学 学生处，云南 昆明 650201)

大量氟氯烃化合物的排放消耗了平流层的臭氧，造成臭氧层衰减，进而导致大气层吸收UVB 辐射(280～315 nm)的能力减弱，地表UV-B 辐射增强成为全球面临的严峻环境问题之一[1-2]。UV-B 辐射增强对植物的生长发育和生理都有不同程度的影响，主要表现在外部形态的变化、DNA 损伤、光合系统被破坏、内源激素含量的改变及生物量和产量下降[3-5]。氮素是水稻体内各种酶、激素等功能蛋白以及叶绿素、核酸、磷脂等结构物质的重要构成成分，氮代谢作为植株最重要的代谢之一，参与到生命活动中物质代谢和能量代谢的多个重要环节[6]。氮素是植物体的重要组成元素之一，影响着植物新陈代谢和体内的资源分配。氮代谢是植物生命活动中最重要也是最基本的生理代谢之一，不仅影响作物的生长发育，而且很大程度上决定着产量和品质[7-9]。硝酸还原酶(nitrate reductase，NR)、谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)与谷氨酸合成酶(glutamate synthase，GOGAT)等氮代谢关键酶活性除了受作物自身遗传基因决定外，对光照、温度和氮素形态等外界环境条件非常敏感[10]。UVB 辐射增强影响植物的氮代谢过程，导致NR、GS和GOGAT 等氮代谢关键酶活性及主要含氮物质如可溶性蛋白、总氨基酸等含量发生变化[11-13]，进而影响产量及品质[14-15]。

水稻(Oryza sativaL.)作为中国主要的粮食作物之一，关于UV-B 辐射增强对水稻氮代谢的影响也有一些研究[9]，但是大多数研究使用的水稻品种都是通过现代杂交育种技术育成的，水稻生长受环境影响很大，易退化，很难与环境协同进化而形成抗性，不适宜开展大田UV-B 辐射增强的长期试验；而且试验基本是在控制或半控制试验条件下进行的，缺乏大田原位种植条件下的研究，然而大田种植条件下长期UV-B 辐射增强对植物的影响具有累积效应[9-10,16]。此外，水稻生长过程中施用大量的农药与化肥也使得其中的生物群落处在不断的变化之中，导致现代品种的稻田生态系统极不稳定[17]。

云南元阳梯田地处滇南低纬度哀牢山区，是一个稳定、可持续的稻田生态系统的典型代表，生长于该梯田的水稻品种具有近300 多年种植历史，对环境和气候变化的适应能力强、遗传稳定，且当地水稻在种植生长过程中，稻田不施用任何化肥和农药，无明显病虫害，产量较为稳定[18]。目前，在大田种植条件下，UV-B 辐射增强对元阳传统水稻氮代谢的影响尚未见报道。本试验以元阳梯田传统水稻品种白脚老粳作为研究对象，在元阳梯田进行大田原位种植，通过模拟不同强度UV-B 辐射强度处理，研究不同UV-B 辐射强度对元阳传统水稻不同生育期叶片NR、GS 和GOGAT 等氮代谢关键酶活性和可溶性蛋白和总氨基酸含量的变化特征，为大田种植条件下持续稳定稻田的实际生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地点与试验材料

1.1.1 试验地概况

试验地位于云南省元阳县新街镇箐口村梯田，海拔1 600 m，N23°7′15.8″、E102°44′45.6″。该地地处滇南低纬度哀牢山山脉南部，属山地季风气候，多雨湿润，年平均温度15 ℃，年平均降水量1 397.6 mm。稻田土壤类型为潜育型，pH 值为6.45，有机质含量为26.8 g/kg，全氮、全磷和全钾含量分别为2.42、0.75 和6.07 g/kg，碱解氮含量为67.5 mg/kg，速效磷和速效钾含量分别为20.7 和150.1 mg/kg[19]。

1.1.2 试验材料

试验材料为元阳梯田地方传统水稻(Oryza sativaL.)品种白脚老粳，在当地已有300 多年的种植历史，是当地主要栽培品种之一。水稻种子来源于元阳县新街镇农科站。2017 年3 月18 日播种育苗，5 月15 日移栽至试验小区内。水稻生长期内不施用任何农药和化肥，整个生育期处于淹水状态。

1.2 试验设计及UV-B 辐射处理

在每行水稻正上方设置升降灯架，悬挂1 支40 W 的UV-B 灯管(北京，UV308，光谱为280～320 nm，北京电光源研究所提供)进行增强UVB 辐射处理并用UV-B 辐射测定仪(北京师范大学光电仪器厂)测定植株顶端辐射强度。试验设UV-B 辐射强度为0 (对照组，自然光照)、2.5、5.0 和7.5 kJ/m24 个处理，分别相当于当地夏至晴天0、10%、20%和30%的臭氧衰减引起的UV-B 的增量，元阳梯田夏至日UV-B 辐射背景值为10 kJ/m2，所设的4 个强度是以背景值为基础，分别增加0、2.5、5.0 和7.5 kJ/m2的UVB 辐射。在水稻植株的生长过程中，不断调节灯管高度以控制辐照度(以植株上部计)，用紫外辐射测定仪(北京师范大学光电仪器厂)测定297 nm 波长处的辐射强度。从水稻秧苗移栽返青直到收获，每天10：00—17：00 辐照7 h (阴雨天除外)。处理期间，用UV-B 测定仪检测水稻植株冠层各辐射梯度的UV-B 辐射强度，通过调整灯管的高度调节UV-B 辐射强度，调节灯管高度选择在傍晚无自然光照时进行。对照植株上方悬挂紫外灯的空灯架，以保证处理和对照植株的自然光条件相同。种植区设4 个处理，分别进行0、2.5、5.0 和7.5 kJ/m2UV-B 辐射处理，各处理重复3 次，每个小区面积为2.25 m×3.9 m，每个小区种植14 行×16 列水稻，每丛1 秧苗。小区的周边设6 行4 列水稻作为保护行。

1.3 测定指标及方法

在水稻生长的分蘖期、拔节期及抽穗期进行取样，取自上而下第2 片展开的功能叶进行各项指标的测定。NR、GS 和GOGAT 活性采用南京生物工程研究所提供的试剂盒进行提取与测定；可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G250 染色法[20]，氨基酸含量采用茚三酮染色法测定[20]。

水稻成熟后于2017 年9 月29 日收获，每个试验小区随机取10 株水稻，测定水稻有效穗数和穗粒数[21]。除去水稻每穗不饱满的籽粒，测定饱满籽粒的数量，饱满籽粒的数量除以穗粒数，即是其结实率；每个小区随机选3 份1 000 粒籽粒样品，测定千粒质量[16]。

1.4 数据处理与统计分析

数据用Microsoft Excel 进行常规分析，并采用SPSS 22 数据软件进行LSD 差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 UV-B 辐射增强对水稻叶片硝酸还原酶(NR)活性的影响

NR 是植物氮代谢中催化NO3-转化为NH4+的第1 步反应的关键酶，在植物氮代谢中起着决定性的作用，其活性高低反映了氮代谢的强弱。由图1 可见：不同的生育时期水稻叶片NR 活性变化规律不同。在分蘖期和拔节期，与对照相比，5.0 kJ/m2UV-B 辐射处理下水稻叶片NR 活性显著增加(P＜0.05)，在2.5 和7.5 kJ/m2UV-B 辐射处理无显著变化；在抽穗期，5.0 kJ/m2UV-B 辐射处理下的NR 活性与对照相比无显著变化，在2.5 和7.5 kJ/m2UV-B 辐射处理下NR活性显著降低(P＜0.05)，与对照相比分别降低了58.2%和62.9%，两处理间差异不显著。

图1 UV-B 辐射增强对水稻叶片硝酸还原酶(NR)活性的影响Fig.1 Effect of enhanced UV-B radiation on the NR activity in rice leaves

2.2 UV-B 辐射增强对水稻叶片谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸合成酶(GOGAT)活性的影响

植物吸收的NO3-最终被还原NH4+，而NH4+同化主要通过GS/GOGAT 循环完成，GS 联合GOGAT 酶催化谷氨酸转化为谷氨酰胺，共同促进氨基酸的合成与转化。由图2 所示：在分蘖期，与对照相比，7.5 kJ/m2UV-B 辐射时水稻叶片GS 活性显著降低(P＜0.05)，在2.5 和5.0 kJ/m2UV-B 辐射时水稻叶片GS 活性与对照之间差异不显著，但两处理间差异显著(P＜0.05)；拔节期和抽穗期，水稻叶片GS 活性表现出先增加后下降的变化规律。与对照相比，2.5 和5.0 kJ/m2UV-B 辐射时水稻GS 活性均显著提高(P＜0.05)，7.5 kJ/m2UV-B 辐射时显著降低(P＜0.05)。

从图2 也可见：在分蘖期和抽穗期，与对照相比，2.5 和5.0 kJ/m2UV-B 辐射时水稻叶片GOGAT 活性没有显著变化，7.5 kJ/m2UV-B 辐射时水稻叶片GOGAT 活性显著降低(P＜0.05)，降低幅度分别为76.8%和88.9%；在拔节期，2.5 和5.0 kJ/m2UV-B 辐射时水稻GOGAT 活性均显著提高，分别提高了49.7%和88.2%，且两处理之间差异显著(P＜0.05)，7.5 kJ/m2UV-B 辐射与对照无显著差异。

2.3 UV-B 辐射增强对水稻叶片可溶性蛋白和总游离氨基酸含量的影响

从图3 可见：在分蘖期和抽穗期，与对照相比，2.5 kJ/m2UV-B 辐射时水稻叶片可溶性蛋白含量没有显著变化，5.0 kJ/m2UV-B 辐射时水稻叶片可溶性蛋白含量显著提高(P＜0.05)，7.5 kJ/m2UV-B 辐射时水稻叶片可溶性蛋白含量显著下降(P＜0.05)；在拔节期，与对照相比，2.5 和5.0 kJ/m2UV-B 辐射处理时水稻叶片可溶性蛋白含量均显著增加(P＜0.05)，两处理间差异不显著，而7.5 kJ/m2UV-B 辐射处理时显著下降(P＜0.05)。

在分蘖期和抽穗期，水稻叶片总游离氨基酸含量变化规律相同，随着UV-B 辐射强度增加呈现先增加后降低的变化趋势，与对照相比，在2.5 和5.0 kJ/m2UV-B 辐射时水稻叶片总游离氨基酸含量显著增加(P＜0.05)，两处理间差异显著(P＜0.05)，7.5 kJ/m2UV-B 辐射时没有显著变化；在拔节期，与对照相比，2.5 kJ/m2UV-B 辐射时水稻叶片总游离氨基酸含量没有显著变化，5.0 kJ/m2UV-B 辐射时显著提高(P＜0.05)，7.5 kJ/m2UV-B辐射时显著下降(P＜0.05) (图3)。

图2 UV-B 辐射增强对水稻叶片谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸合成酶(GOGAT)活性的影响Fig.2 Effect of enhanced UV-B radiation on the activities of GS and GOGAT in rice leaves

2.4 氮代谢酶活性与含氮物质的相关性分析

相关分析发现(表1)：水稻分蘖期可溶性蛋白和总游离氨基酸含量与GS 活性呈显著线性正相关关系(P＜0.05)。拔节期可溶性蛋白含量与GS、GOGAT 活性呈显著和极显著线性正相关关系(P＜0.05 和P＜0.01)，总游离氨基酸含量与NR呈显著线性负相关关系(P＜0.05)。抽穗期可溶性蛋白含量与NR、GS 与GOGAT 活性呈显著和极显著线性正相关关系(P＜0.05 和P＜0.01)，总游离氨基酸含量与GS 呈极显著线性正相关关系(P＜0.01)。这表明可溶性蛋白和总游离氨基酸含量是衡量UV-B 辐射增强对水稻氮代谢影响程度的重要指标，同时与氮代谢关键酶(NR、GS 与GOGAT)活性密切相关。

2.5 UV-B 辐射增强对白脚老粳产量及其构成因素的影响

随着UV-B 辐射处理强度的增加，白脚老粳的有效穗数、穗粒数、千粒质量、结实率与产量均出现不同程度的下降。与对照相比，UV-B 辐射为5.0 和7.5 kJ/m2时，白脚老粳的有效穗数、穗粒数和千粒质量显著下降(P＜0.05)，2 个处理间差异不显著，且在7.5 kJ/m2UV-B 辐射时有效穗数、穗粒数和千粒质量的降幅均达到最大，分别为18.1%、13.4%和20.7%。UV-B 辐射增强，白脚老粳结实率显著下降，且5.0 和7.5 kJ/m2UV-B 辐射间差异不显著。UV-B 辐射增强导致白脚老粳产量显著降低，但是不同UV-B 辐射处理间差异没有达到显著水平，7.5 kJ/m2UV-B 辐射时降幅达到了最大为22.8% (表2)。相关性分析表明：白脚老粳产量与千粒质量、结实率呈极显著(P＜0.01)和显著正相关(P＜0.05) (表3)。

图3 UV-B 辐射增强对水稻叶片可溶性蛋白和总游离氨基酸含量的影响Fig.3 Effect of enhanced UV-B radiation on the contents of soluble protein and total free amino acids in rice leaves

表1 氮代谢酶活性与含氮物质的相关性分析Tab.1 Correlation analysis of nitrogen metabolizing enzyme activities and nitrogen-containing substances

表2 UV-B 辐射增强对水稻产量的影响（mean±SD）Tab.2 Effect of enhanced UV-B radiation on the yield of rice

表3 水稻产量与产量构成因素之间的相关系数Tab.3 Correlation coefficients between yield components and yield of rice

3 讨论

3.1 UV-B 辐射增强对水稻叶片氮代谢关键酶的影响

硝酸还原酶(NR)是植物氮代谢第一步NO3-转化为NH4+过程中的调节酶，是一种诱导酶，同时也是限速酶，不仅对外界环境胁迫敏感，而且在作物对氮素的吸收利用中起着关键性的作用[22]。研究发现：NR 活性在水稻生育期内分蘖期达到最高，其后随着生育时期向后发展，活性逐渐减弱，成熟期最弱[22]。本试验中，5.0 kJ/m2UV-B 辐射处理显著诱导水稻分蘖期NR 活性增加，增加幅度达到633.6%。这与在颠茄、谷子和小麦上的研究结果基本相似[12-13,23]。UV-B 辐射增强导致植物氮代谢NR 活性提高是因为光强一方面改变了细胞膜对NO3-的通透性，使细胞内NO3-浓度提高，进而诱导NR 的活性提高；另一方面使NR 脱磷酸化，使其活性提高；除此之外，光强还在一定程度上影响了细胞质的pH 值及NAD(P)H 的水平，进而影响了植物NR 的活性[24]。随着生育期向后发展，NR 活性变化趋势发生了改变，同样是5.0 kJ/m2UV-B 辐射处理下，水稻拔节期叶片NR 活性显著下降。曾有专家推测UV-B 辐射降低植物体内NR 活性的原因可能是因为UV-B 辐射增强影响植物体内一些重要物质的代谢，进而影响NR 蛋白的稳定性[24]。但在棉花上，甚至在其他水稻品种上也有截然相反的研究结果[9,11]，其原因可能是不同植物或品种对UV-B 辐射强度的响应不同。

水稻直接吸收的NH4+和NR 酶还原NO3-所生成的NH4+在水稻体内必须很快通过转氨基作用同化为氨基酸或酰胺以避免NH4+累积对细胞造成毒害[25]。谷氨酰胺合成酶(GS)作为联系氮素同化代谢与无机代谢的关键酶，其活性的提高有利于植物铵的同化和氮素的转运，其活性降低可使细胞内多种碳氮代谢酶活性受到严重影响，它与谷氨酸合成酶(GOGAT)二者偶联形成循环共同参与氨的同化，GS/GOGAT 的活性高低反映着蛋白质的合成能力[26]，与NR 活性一样，容易受外界逆境胁迫环境的影响[27]。本试验中，分蘖期，2.5 和5.0 kJ/m2UV-B 辐射强度对水稻GS 酶活性无影响，在7.5 kJ/m2UV-B 辐射强度显著抑制了水稻GS 酶活性，到了拔节期和抽穗期，UV-B辐射增强对GS 酶活性影响规律是一致的，都是随UV-B 辐射强度的增加GS 酶活性先增加之后又下降，均在5.0 kJ/m2UV-B 辐射强度时达到最大。说明一定剂量的UV-B 辐射能提高GS 活性，并且随着生育时期的推移，GS 活性不断增加，表现出对UV-B 辐射的适应性不断增加。GS 活性具有生育期效应和UV-B 辐射剂量效应，对水稻氮代谢具有重要的影响。

GOGAT 酶活性随UV-B 辐射强度的变化规律不尽相同，在分蘖期和抽穗期，2.5 和5.0 kJ/m2UV-B 辐射强度时水稻叶片GOGAT 酶活性无显著影响，但在7.5 kJ/m2UV-B 辐射强度时显著下降，在拔节期表现出一定的耐性特征，2.5 和5.0 kJ/m2UV-B 辐射强度时水稻叶片GOGAT 酶活性均显著提高，在5.0 kJ/m2UV-B 辐射强度时达到最大，7.5 kJ/m2UV-B 辐射时又下降。说明UV-B 辐射增强促进氮由有机态向无机态的转化，但这种促进作用对UV-B 辐射强度有剂量阈值的要求，超过了这个剂量阈值，水稻叶片GS 和GOGAT 酶活性会受到抑制，从而抑制水稻氮代谢。有研究人员在小麦、棉花和颠茄的研究上也得出了相似的结论[11-13]。团队前期研究发现：5.0 kJ/m2UV-B 辐射强度能刺激水稻生长并促进水稻植株的光合作用[28-29]，这在一定程度上为NH4+同化提供了足够的碳骨架和能量，从而诱导GS/GOGAT 的活性变化，加快NH4+同化，来抵御UV-B 辐射增强带来的伤害。

3.2 UV-B 辐射增强对水稻叶片氮代谢重要产物的影响

可溶性蛋白和游离氨基酸是有机氮代谢阶段重要的代谢产物。研究发现：UV-B 辐射增强会导致灯盏花叶总游离氨基酸含量的累积[14]，使春小麦分蘖期、拔节期和扬花期的叶片可溶性蛋白含量显著下降而成熟期可溶性蛋白含量显著增加[15]。ZU 等[30]研究了10 个小麦品种对UV-B 辐射增强处理的响应时发现：有5 个品种的可溶性蛋白含量随着UV-B 辐射增强而下降，而有5 个品种的可溶性蛋白含量随着UV-B 辐射增强而增加。

在本试验中，5.0 kJ/m2UV-B 辐射时，水稻各生育时期可溶性蛋白含量和总氨基酸含量均显著增加，而7.5 kJ/m2UV-B 辐射处理时，水稻各生育时期可溶性蛋白含量及拔节期总游离氨基酸含量显著下降，进一步说明水稻对UV-B 辐射强度的适应有一定的阈值，在这个阈值之内，UVB 辐射增强有利于水稻叶片氮代谢主要产物合成与转化，一旦超过这个阈值，UV-B 辐射增强不利于水稻叶片氮代谢主要产物的合成和转化。相关性分析表明：UV-B 辐射增强下，水稻叶片可溶性蛋白和总氨基酸含量与其氮代谢关键酶活性密切相关。

UV-B 辐射增强条件下，植株叶片总游离氨基酸含量的增加有利于植物对逆境的抵御，而可溶性蛋白含量的增加，一方面说明逆境对植物细胞造成了损伤，另一方面这种变化带来细胞渗透浓度和功能蛋白数量的增加，这种结果有利于维持植物细胞的正常代谢，从而减轻逆境带来的伤害[31]。也有部分研究发现：UV-B 辐射增强导致水稻可溶性蛋白的含量下降[32-34]，原因可能与水稻品种和生育期不同酶适应特征等有关。

3.3 UV-B 辐射增强对白脚老粳产量的影响

单位面积有效穗数、穗粒数、结实率和千粒质量是水稻产量构成关键因素，也是评估外界环境胁迫影响水稻生长发育的重要指标。产量是评估环境胁迫因子影响作物的关键指标，UV-B 辐射增强影响了作物形态建成及产量形成过程，最终导致产量下降[35]。本试验中，UV-B 辐射增强导致白脚老粳产量下降，这与大多数研究结果相同[13-14]，相关性分析表明：UV-B 辐射增强导致白脚老粳千粒质量和结实率显著减小，是其导致产量显著下降的主要原因。尽管本试验中5.0 kJ/m2UV-B 辐射时促进了水稻叶片氮代谢，但可能因为水稻为抵御UV-B 辐射增强的胁迫，提高自身的抗性而消耗了生长过程中所需求的代谢产物和能量，最终导致其产量下降。

4 结论

大田原位种植下，UV-B 辐射增强对水稻叶片氮代谢的影响具有明显的“剂量+生育期”效应。5.0 kJ/m2UV-B 辐射时水稻分蘖期叶片NR活性、各生育期叶片GS 和GOGAT 酶活性、可溶性蛋白及游离氨基酸含量显著增加，拔节期NR 活性显著降低。7.5 kJ/m2UV-B 辐射时水稻各生育期叶片的NR、GS 与GOGAT 活性、可溶性蛋白含量及总氨基酸含量均显著降低。UV-B 辐射增强抑制白脚老粳有效穗数、穗粒数、结实率和千粒质量，导致产量下降。