湘西“蒿菜粑粑”原料植物鼠麴草总黄酮提取物体外抗氧化活性研究

陈加蓓，李云峰，周 雯，颜静茹，张帆靖，陈功锡

(1. 吉首大学药学院，湖南 吉首 416000；2. 吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南 吉首 416000；3. 湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128)

鼠麴草(Gnaphalium affine)俗称清明菜、田蒿，作为我国传统中草药，是湘西民族传统特色食品“蒿菜粑粑”的原料植物之一，产于我国多个省区[1—2]。研究表明，鼠麴草在抗组胺、抗心衰、黄嘌呤氧化酶抑制、护肝和降尿酸等方面具有优良的药理活性[3—4]。本课题组前期研究发现该植物具有抑菌与抗氧化活性，其中抑菌活性成分可能为黄酮类化合物，其他研究也发现黄酮类化合物是鼠麴草主要功效成分之一[5—7]。此外，许多植物黄酮提取物均有良好的抗氧化活性，是当前抗氧化剂研究领域的热点，已在食品、药品、化妆品等多个领域应用[8—9]。黄酮类化合物可通过直接清除自由基、抑制自由基产生、激活机体抗氧化等体系发挥抗氧化作用[10]。目前，有关黄酮类化合物的提取研究较多[11—14]，但鼠麴草黄酮类化合物抗氧化活性的报道颇少。湘西地区处于植物多样性极其丰富的武陵山区，具有丰富的鼠麴草植物资源。因此，这一具有民族特色的食品“蒿菜粑粑”原料植物具有较大的经济价值和应用前景。本实验针对微波提取鼠麴草总黄酮的体外抗氧化活性进行研究，为鼠麴草的进一步应用提供依据，也为湘西“蒿菜粑粑”推广及产业化提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验用“蒿菜粑粑”原料植物鼠麴草样品于2019年4月采自湖南省吉首市吉首大学砂子坳校区对面山及后山，经吉首大学张代贵高级工程师鉴定为鼠麴草(Gnaphalium affineD. Don)。将鲜鼠麴草洗净晾干后于50 ℃恒温干燥，粉碎，过30目筛，装袋备用。无水乙醇、三氯化铁、过氧化氢、氯化亚铁、维生素 C(Vitamin C，VC)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl Free Radical，DPPH)、2，2'-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐[2，2′-amino-di (3-ethylbenzthiazoline sulphonicacid- 6)ammonium salt，ABTS]、 2，6-二叔丁基对甲酚(Butylated Hydroxytoluene，BHT)等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

LE204E/02电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；XMTD-7000型电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)；KQ-250DE型数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；RE-2000A型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；UV-2600紫外可见分光光度计[岛津仪器(苏州)有限公司]。

1.3 方法

1.3.1 鼠麴草总黄酮提取及含量测定

1.3.1.1 供试品溶液制备

参考文献[5]方法，采用微波提取法(液料比35:1，乙醇体积分数40%，微波提取时间9 min，提取温度50 ℃)进行鼠麴草总黄酮提取液制备，多次提取后合并提取液，浓缩，用40%乙醇25 mL定容，即得鼠麴草总黄酮母液。在测得鼠麴草总黄酮母液的总黄酮浓度后，对母液进行浓度梯度稀释获得不同浓度鼠麴草总黄酮溶液样品用于后续抗氧化实验。

1.3.1.2 总黄酮含量测定

黄酮含量测定使用硝酸铝法[5]。置于506 nm处测定吸光度值，按照曲线方程y=0.0166x-0.0231，r2=0.9987，测得浓度即为鼠麴草总黄酮母液浓度，置于4 ℃冰箱备用。

1.3.2 鼠麴草总黄酮体外抗氧化活性测定

1.3.2.1 DPPH自由基清除实验

参考王翔等[14]的方法测定总黄酮对DPPH自由基的清除效果。取一定量的 DPPH，用95%乙醇溶解并配制成 0.058 mg·mL-1溶液。将样品与其他试剂的量均扩大1倍，在517 nm测定吸光度值。

1.3.2.2 ABTS自由基清除实验

参考王翔等[15]的方法测定总黄酮对ABTS自由基的清除效果。将样品与其他试剂的量均扩大 0.5倍，在731 nm波长下检测。

1.3.2.3 总还原能力测定

参考冯小雨等[16]的方法测定总黄酮的总还原能力。

1.3.2.4 铁还原能力测定

参考 Xu等[17]的方法测定总黄酮铁还原能力。将样品与其他试剂的量均扩大1倍，在599 nm测定。

1.3.2.5 β-胡萝卜素褪色实验

参考李臻等[18]的方法进行 β-胡萝卜素褪色实验。β-胡萝卜素6 mg溶于1 mL氯仿，加入40 μL亚油酸，400 μL吐温80，充分混匀。旋转蒸发除去氯仿，立即加入10 mL蒸馏水，将溶液转至250 mL容量瓶，用 0.01 mol·L-1H2O2配成 250 mL。取 10 mL于试管，并加入 1 mL样品溶液、阳性对照(VC和BHT)(20 mg·L-1)、空白溶剂(正常对照组)，混合均匀，置于50 ℃水浴，每30 min 测定470 nm处吸光度值，直至胡萝卜素相关色度百分比小于25%。

式中，Acontrol为空白组的吸光度；Atest为样品组的吸光度；t为反应时间。

1.3.2.6 硫氰酸铁实验

参考张京芳等[19]的方法进行总黄酮的硫氰酸铁实验。

1.3.2.7 硫代巴比妥酸实验

参考祁英等[20]的方法进行总黄酮的硫代巴比妥酸实验。取硫氰酸铁实验的反应液1 mL，加入2 mL 20%三氯乙酸水溶液，在波长533 nm下测定吸光度。

1.3.3 数据处理

样品平行测定3次，结果以平均值的形式表示，使用Microsoft office Excel 2010统计软件进行数据处理与制图。

2 结果与分析

2.1 鼠麴草总黄酮含量

在506 nm处测定鼠麴草总黄酮的吸光度值，按照图1曲线方程计算总黄酮浓度，测得鼠麴草总黄酮母液中总黄酮浓度为7.01 mg·mL-1。

图1 芦丁标准曲线Fig. 1 Standard curve of rutin

2.2 鼠麴草总黄酮对DPPH自由基的清除效果

通过测定总黄酮与DPPH在517 nm处的吸光度值评价鼠麴草总黄酮对自由基的清除效果[21]。从图2可以看出，在实验浓度范围内，随着浓度增大，鼠麴草总黄酮、VC和BHT对DPPH自由基的清除能力都变强，当浓度大于5 mg·L-1后，鼠麴草总黄酮对DPPH自由基的清除力一直高于BHT，浓度为1280 mg·L-1时，达到最大清除率86.91%，鼠麴草总黄酮的半数抑制质量浓度(IC50)为 16.30 mg·L-1，而BHT和VC的最大清除率分别为83.99%、95.94%，IC50分别为34.62、8.09 mg·L-1，表明鼠麴草总黄酮对 DPPH自由基的清除能力强于 BHT，但略弱于VC。鼠麴草总黄酮对DPPH自由基清除能力较强且呈现剂量依赖性。

图2 鼠麴草总黄酮对DPPH自由基的清除效果Fig. 2 Scavenging effect of total flavonoids of Gnaphalium affine on DPPH free radical

2.3 鼠麴草总黄酮对ABTS阳离子自由基的清除效果

由图3可知，鼠麴草总黄酮具有一定ABTS阳离子自由基清除能力，在 1.25～160 mg·L-1浓度范围内，对ABTS阳离子自由基的清除率呈上升趋势，在160 mg·L-1浓度时，达到最大清除率99.30%，总黄酮的IC50为30.16 mg·L-1，而BHT和VC的最大清除率分别为98.61%、100.00%，IC50分别为55.15、16.06 mg·L-1，表明鼠麴草总黄酮与 BHT对 ABTS阳离子自由基的最大清除率基本一致，鼠麴草总黄酮对ABTS阳离子自由基的清除能力强于BHT略弱于VC。鼠麴草总黄酮对ABTS阳离子自由基有较强的清除能力，并呈现剂量依赖性。

图3 鼠麴草总黄酮对ABTS阳离子自由基的清除效果Fig. 3 Scavenging effect of total flavonoids of Gnaphalium affine on ABTS+ free radical

2.4 鼠麴草总黄酮的总还原能力

由图4可以看出，鼠麴草总黄酮具有一定总还原能力，在1.25～2000 mg·L-1浓度范围内的吸光度值呈上升趋势。总体来看，相同浓度条件下各物质还原能力顺序为：BHT＞VC＞鼠麴草总黄酮，表明鼠麴草总黄酮具有一定的总还原能力，但弱于BHT和VC。鼠麴草总黄酮有一定的总还原能力且具剂量依赖性。

图4 鼠麴草总黄酮的总还原能力Fig. 4 Total reduction ability of total flavonoids in Gnaphalium affine

2.5 鼠麴草总黄酮的铁还原能力

由图5可知，鼠麴草总黄酮在10～5120 mg·L-1浓度范围内的吸光度值呈上升趋势，在同样浓度范围内，BHT的铁还原能力也渐渐增强，高浓度 VC的铁还原能力呈稍降低趋势。总体看来，在一定浓度范围内，三者的还原力与浓度有一定的量效关系，其中鼠麴草总黄酮的铁还原能力大于其他二者。鼠麴草总黄酮的铁还原能力较强，也有剂量依赖性。

图5 鼠麴草总黄酮的铁还原能力Fig. 5 Iron reduction ability of total flavonoids of Gnaphalium affine

2.6 鼠麴草总黄酮的β-胡萝卜素褪色速率

β-胡萝卜素褪色实验是基于乳状液中亚油酸自动氧化生成的自由基能使 β-胡萝卜素黄色衰减(在470 nm处吸光度减小)，当有抗氧化剂存在时，β-胡萝卜素褪色速率减缓[22—23]。在 20 mg·L-1浓度下，当胡萝卜素相对吸光度降至 50%时，加入 VC和BHT组所需时间为48.62、51.25 min，加入鼠麴草总黄酮组的时间为67.49 min(图6)。由此可知，鼠麴草总黄酮能有效地延缓β-胡萝卜素褪色，且优于VC和BHT。

图6 鼠麴草总黄酮对胡萝卜素褪色的影响Fig. 6 The inhibitory effect of total flavonoids of Gnaphalium affine on the fading of carotene

2.7 鼠麴草总黄酮抑制脂质过氧化能力

硫氰酸铁比色实验是基于在酸性条件下，脂质氧化形成的过氧化物可将Fe2+氧化成Fe3+，随后Fe3+与硫氰酸根离子形成在特定检测波长(480～515 nm)内有最大吸收的红色络合物[24]。由图7可见，正常对照组的吸光度值随着时间延长而增大，且在第 7天达到最大值，BHT吸光度值随时间延长没有明显改变，说明 BHT具有最佳的抑制脂质过氧化的能力。VC、鼠麴草总黄酮吸光度值随时间的延长有一定程度的增加，但始终低于正常对照组水平，抑制脂质过氧化的能力顺序为：鼠麴草总黄酮＞VC，表明 VC和鼠麴草总黄酮均具有一定的抑制脂质过氧

图7 硫氰酸铁法测定鼠麴草总黄酮抗氧化性Fig. 7 Determination of antioxidant activity of total flavonoids of Gnaphalium affine by ferric thiocyanate method

3 讨论与结论

抗氧化剂是通过帮助捕获与中和自由基，从而除去自由基对人体造成损害的物质，故在抗衰老研究中有重要意义。黄酮类化合物作为广泛存在于自然界的天然抗氧化剂已受到广泛关注。研究表明，黑豆含有丰富的黄酮类化合物，使得黑豆比其他豆类具备更高的自由基清除能力与总抗氧化能力[26]。本研究显示，鼠麴草总黄酮对DPPH和ABTS阳离子自由基有一定清除能力，且呈现剂量依耐性；具备较强的还原能力、延缓胡萝卜素褪色效果和抑制脂质过氧化能力，也呈剂量依耐性，说明鼠麴草总黄酮具备较强的抗氧化能力，鼠麴草的抗氧化能力与其总黄酮含量紧密相关。廖鹏飞等[27]研究也发现，化的能力，且鼠麴草总黄酮优于VC。可见鼠麴草总黄酮具有较好的抑制脂质过氧化能力。

硫代巴比妥酸实验的原理是脂质过氧化的降解产物之一丙二醛可与硫代巴比妥酸发生成色反应，通过对在533 nm处测定的吸光度值进行比较，可了解样品的脂质过氧化情况[25]。由图8可知，BHT、鼠麴草总黄酮、VC的吸光度值均低于正常对照值，其抑制率分别为94.36%、79.97%、48.66%，表明鼠麴草总黄酮的抑制脂质过氧化能力强于VC，但弱于BHT。可见鼠麴草总黄酮具有较好的抑制脂质过氧化能力。鼠麴草中黄酮类化合物具有较好的抗氧化活性，是鼠麴草的抗氧化活性成分。

图8 硫代巴比妥酸法测定鼠麴草总黄酮的抗氧化性Fig. 8 Determination of antioxidant activity of total flavonoids of Gnaphalium affine by thiobarbituric acid method

综上所述，鼠麴草总黄酮提取物可被用作天然的抗氧化剂，广泛用于药品、食品、化妆品、保健品等多个领域，该研究为鼠麴草制作的食品“蒿菜粑粑”的产业化发展提供依据。