桃核承气汤对慢性肾衰竭大鼠肾组织中Axin表达的影响*

张喜奎 林祥发 马 来 王旭丽 李灵辉 朱为坤

慢性肾衰竭是各种慢性肾脏病引起肾单位不可逆性破坏，以致残存肾单位不足以充分排除代谢废物及维持内环境稳定的病理过程，从中医学理论这一层面上来看，与“关格”非常相似。笔者临床上运用桃核承气汤加减化裁治疗慢性肾衰竭中取得确切疗效，但分子生物学机理尚未阐明。在这样的背景下，本研究将5/6肾切除大鼠作为实验模型，研究桃核承气汤延缓慢性肾衰竭的机理。

1 材料与方法

实验材料本研究，以125只大鼠为实验对象，大鼠的体质量波动在180～200 g。按照随机方式进行分笼，提供标准饲料、超纯水进行喂养，1周后开始实验。主要药物和试剂：①桃核承气汤：本校附属第二人民医院开具饮片，经过煎煮之后，形成浓缩液。②尿毒清颗粒。③注射用青霉素钠：80万U/支，鲁抗制药生产。④Wnt1抗体Abcam Number:ab15251；Axin CST Number:3323；β-catenin抗体Number:51067-2-AP；β-actin抗体 Number:660091-1g。

1.2 实验方法

1.2.1 造模将125只大鼠按照相同的方式饲养7 d后，按照随机方式进行分组。对模型组、尿毒清组、核桃承气汤组的大鼠，将5/6肾切除，实施手术造模。根据体质量估算麻醉剂量，禁食不禁水12 h，防止麻醉状态误吸；在腹腔部位注入水合氯醛，待麻醉药发挥作用后，立即手术；首次手术沿着左肾肋脊角将左肾位置确定，备皮，利用碘伏进行消毒处理，使用组织剪依序分离皮肤、肌肉，打开腹腔剪除所需肾组织用止血海绵按压止血后逐层缝合；完成手术之后，连续3 d在腹腔注射青霉素，达到预防感染的效果；在手术之后的第7天，结扎并剪除右肾。假手术组分次剥离大鼠双肾被膜。造模后经眼底采血，观察血尿素氮、血肌酐变化，若明显升高，则说明造模成功[1，2]。

1.2.2 灌胃每日上午9:00将药物放在EP管中，经过恒温水浴处理后进行灌胃，桃核承气汤组饮片煎煮后浓缩液进行灌胃；对尿毒清组的大鼠，利用温水溶解颗粒后的混悬液进行灌胃；对剩下3组的大鼠，灌以等量生理盐水，持续时间为56 d，每隔7 d称重，如实记录体质量，了解体质量变化情况，及时调整灌胃剂量。

1.2.3 标本采集第57天，麻醉后经腹主动脉采集血液检测血肌酐、血尿素氮、血红蛋白、红细胞计数；取肾组织，50%肾组织进行HE病理染色；剩下50%对半切开分置冻存管，用于Wb、PCR检测。

1.3 观察内容

1.3.1 一般情况精神表现、大鼠毛发、灵敏度等，每隔7 d称重，如实记录体质量，了解体质量变化情况。

1.3.2 肾组织HE染色病理将肾组织修整为1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm，放入5%多聚甲醛置于冰箱中固定24 h后，流水冲刷6 h。用乙醇依次从60%以10%为梯度逐步脱水至100%，再放入二甲苯中置换出乙醇。随后放入恒温箱浸没在石蜡中待凝固。粗修蜡块后将其固定在卡槽，以5 μm为度切成薄片，轻放于预热好的摊片机上，随后用载玻片将平整的蜡片捞起进行烤片，经脱蜡、水化、苏木精、伊红染色后，再次用酒精、二甲苯脱水、透明后，用中性树胶封片。采用光学放大倍400倍数进行观察。见表1。

1.3.3 血象监测经腹主动脉取血后，将血浆置于抗凝管中，反复倒置数次，尽快运用全自动动物血液分析仪检测红细胞计数、血红蛋白，全自动生化分析仪检测血肌酐、血尿素氮。

1.3.4 实时荧光定量PCR检测在反扣有冰的培养皿上取0.1 g肾组织迅速装入0.8 ml裂解液及2粒瓷珠均需匀浆，频率为20振荡至管内无明显可见颗粒，再加入0.2 ml裂解液避免初次装入过多致离心管爆裂。以4 ℃，13000 rmp转速，离心5 min，剥离上层脂肪层，用移液器抽吸上清液至新的离心管。加入300 μl氯仿，振荡静置后，离心至三层水相，将上层无色水相抽吸分离RNA。再加入600 μl异丙醇混匀、静置、离心，使RNA沉淀。最后洗涤RNA，再以DEPC水溶解RNA沉淀后，吹打均匀，用移液器取2 μl样本，分光光度计(A260/280比值)测定其纯度及浓度，并进行逆转录合成cDNA反应，最后进行荧光定量检测mRNA的相对表达量。

表1 引物序列(5’→3’)

1.3.5 免疫蛋白印迹WB检测根据目的蛋白选取不同浓度的分离胶，注胶后加入超纯水平衡液面，再以同法注入上层胶，并插入加样孔梳。将胶板置入、电泳缓冲液置入电泳槽，依次加入Marker 5 μl及待测试样本，先以50 V低电压，后以90 V电压电泳，待溴酚蓝条带接近胶底为止。用PVDF膜裁切成合适大小，置入样品胶与滤纸间，排除气泡后进行转膜，而后用去离子水洗去膜上甲醛，用脱脂奶粉溶液封闭1～2 h。随后进行一抗、二抗孵化，采用ECL发光液曝光，测定吸光度与内参比值。

1.4 统计学方法选择SPSS 20.0进行分析，按照均数±标准差的方式进行表达，通过单因素方差分析比较组间差异。P<0.05时，表明差异具有统计学意义；反之，如果P>0.05，就表明差异不具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况空白组和假手术组大鼠毛色光亮洁白，反应灵敏；模型组大鼠体型瘦小，反应迟钝，毛色灰暗，灌胃时出现“竖毛”表现。桃核承气汤组大鼠毛色略灰暗，反应稍迟钝。

2.2 各组大鼠红细胞计数、血红蛋白比较模型组RBC及Hb数值较空白组明显降低(P<0.05)；桃核承气汤组、尿毒清组RBC及Hb数值较模型组升高(P<0.05)。桃核承气汤组与尿毒清组无明显差异(P>0.05)。结论：桃核承气汤能使CRF大鼠的RBC及Hb含量升高。见图1、图2。

图1 各组大鼠红细胞计数的实验结果比较

图2 各组大鼠血红蛋白的实验结果比较

2.3 各组大鼠血肌酐、血尿素氮比较模型组血肌酐、尿素氮水平较空白组明显升高(P<0.05)；桃核承气汤组、尿毒清组血肌酐、尿素氮水平较模型组降低(P<0.05)。结论：桃核承气汤能使CRF大鼠的血肌酐、血尿素含量降低。见图3、图4。

2.4 各组大鼠左肾组织HE病理空白组和假手术组肾脏形态、结构完整，肾小球、肾小管结构正常无紊乱；假手术组偶有炎症细胞浸润；模型组肾小球固缩，基膜增厚、间质纤维增生、炎性细胞浸润；桃核承气汤组肾小球硬化程度较模型组、尿毒清组改善。见图5。

图3 各组大鼠血肌酐的实验结果比较

图4 各组大鼠血尿素氮的实验结果比较

2.5 各组大鼠左肾组织Wnt1、β-catenin、Axin mRNA表达比较桃核承气汤组Wnt1、β-catenin较模型组显著降低(P<0.05)，Axin表达较模型组显著升高(P<0.05)，且优于尿毒清组。结论：桃核承气汤使CRF大鼠Wnt1、β-catenin的mRNA表达显著降低，Axin表达明显升高。见表2。

表2 各组大鼠左肾组织Wnt1、β-catenin、Axin mRNA表达比较 (只，

图5 各组大鼠左肾组织HE病理染色

2.6 各组大鼠左肾组织Wnt1、β-catenin、Axin蛋白表达比较桃核承气汤组的Wnt1、β-catenin的蛋白表达较模型组明显降低，而Axin表达较模型组显著升高。结论：桃核承气汤使CRF大鼠Wnt1、β-catenin的蛋白表达显著降低，Axin表达明显升高。

表3 各组大鼠左肾组织蛋白表达的2-ΔΔCT值比较 (只，

3 讨论

慢性肾衰竭归属于中医学“关格”范畴，其主要病机是正气衰败，浊毒、瘀血内阻。在《伤寒论》中，对核桃承气汤做出了较为详细的记载，两者发病机理、临床表现、治疗方式，都存在一些相似的地方。①发病机理都是正虚邪实。慢性肾衰竭的脏腑亏虚为本，浊毒和瘀血互结，形成邪实，桃核承气汤的病机主要为瘀浊蕴结。从发病机理上来看，都存在瘀浊壅滞[3]。②从临床症状上来看，这两者存在很多相似的地方，桃核承气汤的主症除了较为常见的大便色黑、小便自利之外，还包括谵语烦躁、少腹急结等。而慢性肾衰竭的临床症状主要包括：面色黧黑，肌肤甲错；进入晚期后，出现少尿甚至无尿，和桃核承气汤的硬满不适、少腹急结非常相似；慢性肾衰竭由于代谢产物蓄积损伤神经系统，早期可见烦躁、焦虑、不宁腿，进入晚期后，对外界刺激相对淡漠，和桃核承气汤证候所出现的精神状况类似，且两者在治法上有共同性，在治疗过程中，既可以采取泄浊通腑和活血化瘀的手段，达到治疗的效果。结合诸多文献及临床实践，故实验拟通过桃核承气汤，探讨治疗慢性肾衰竭可能作用机制[4,5]。

慢性肾功能不全时，机体为了维持正常代谢需要，健存肾单位负荷加重。本次试验采用5/6肾切除模型亦是据健存肾单位学说，以残肾模拟高灌注、高滤过、高代谢状态符合本病发病机制且相对成熟，故予选用。大量研究表明，肾纤维化作为CRF的病理基础与肾功能损害程度密切相关，贯穿慢性肾衰竭的全程。因此抗肾纤维化对延缓慢性肾衰竭进展起到较为重要的作用[6,7]。从相关研究结果来看，Wnt/β-catenin信号通路被证明有肾纤维化、急性肾损伤、慢性肾衰竭等多种疾病发展中起着重要作用[8,9]。对信号转导进行分析，上游Wnt蛋白激活后，细胞内β-catenin的不断增加，致肾脏纤维化发生发展，为此阻断信号通路持续活化、抑制肾纤维化进程，对延缓慢性肾衰竭进展至关重要[10-12]。故在实验过程中，选择上游Wnt1、中游Axin和下游β-catenin。

综上所述，通过实验发现桃核承气汤组大鼠较模型组于一般情况、红细胞计数、血尿素氮和血红蛋白及分子生物学指标等均出现了明显的改善现象。桃核承气汤能通过抑制5/6肾切除大鼠模型中Wnt/β-catenin信号通路，下调Wnt1、β-catenin和上调Axin表达，减慢肾纤维化进展，从而延缓慢性肾衰竭的进程。