牧草青贮乳酸菌研究进展

张志飞，王青兰

（湖南农业大学 农学院，湖南 长沙 410128）

新鲜的或萎蔫的或者是半干的青绿饲料（牧草、饲料作物、多汁饲料及其他新鲜饲料），在密闭条件下利用青贮原料表面上附着的乳酸菌发酵作用，或者在外来添加剂的作用下促进或抑制微生物发酵，使青贮原料pH 值下降而保存的饲料叫青贮饲料，这一过程称为青贮。青贮过程中发挥重要作用的微生物是乳酸菌 （Lactic acid bacteria，LAB）［1］。乳酸菌是能利用可发酵性碳水化合物中产生乳酸的细菌总称。目前已知的乳酸菌多数属于厚壁菌门细菌，分布在4 纲7 目18 科的39 属；另外还有少量放线菌门细菌属于乳酸菌［2］。

1 乳酸菌发酵类型

乳酸发酵（Lactic Acid Fermentation）是指某些微生物利用葡萄糖经无氧发酵而生成乳酸的过程。根据代谢途径不同，乳酸菌可分为专性同型发酵（Obligately homofermentative）、 专 性 异 型 发 酵（Obligately heterofermentative） 及兼 性 异 型 发 酵（Facultatively heterofermentative） 三种类型［3-4］。

专性同型乳酸菌在厌氧环境下利用葡萄糖为底物通过糖酵解途径（Embden-Meyerhof-Parnas pathway，EMP 途径）产生中间产物丙酮酸，进一步产生乳酸。理论上可以将1 mol 葡萄糖转化生成2 mol 乳酸。同型发酵乳酸菌主要包括乳杆菌属（Lactobacillus）的嗜酸乳杆菌（L. acidophilus）、唾液乳杆菌（L.salivarius）、德氏乳杆菌（L. delbrueckii）、瑞士乳杆菌（L.helveticus）、瘤胃乳酸杆菌（L.ruminis）、片球菌属（Pediococcus）的有害片球菌（P. damnosus）等。

专性异型乳酸菌在厌氧环境下以葡萄糖为底物通过戊糖磷酸途径（Hexose Monophosphate Pathway，HMP途径）经过5步酶催化作用产生5-磷酸-木酮糖，然后进入磷酸酮解酶途径（Phosphoketolase Pathway），在磷酸酮解酶的催化作用下分解为乙酰磷酸和3-磷酸-甘油醛；乙酰磷酸最终转化为乙醇；而3-磷酸-甘油醛经EMP 途径生成丙酮酸，进一步产生乳酸。专性异型发酵乳酸菌主要有乳杆菌属（Lactobacillus）的布氏乳杆菌（L. buchneri）、短乳杆菌（L.brevis）、发酵乳杆菌（L. fermenum）、罗伊氏乳菌（L.reuteri）、明串珠菌属（Leuconostoc）和魏斯氏球菌属（Weissella）的细菌。

兼性异型发酵乳酸菌兼具进行同型乳酸发酵和异型乳酸发酵途径，发酵产物与发酵原料、发酵环境密切相关。主要兼性异型发酵乳酸菌包括：乳杆菌属（Lactobacillus）的植物乳杆菌（L.plantarum）、干酪乳杆菌（L.casei）、弯曲乳杆菌（L.curvatus）、草乳杆菌（L. graminis）、沙克乳杆菌（L.sakei）、戊糖乳杆菌（L. pentosus）、鼠李糖乳杆菌（L. rhamnosus），片球菌属（Pediococcus）的乳酸片球菌（P.acidilactici）、戊糖片球菌（P. pentosaceus）和屎肠球菌（Enterococcus faecium） 等［5-6］。

2 表面附生乳酸菌种群分布

附生微生物（Epibiotic mincroorganism）是指生活在植物上的附生微生物。植物附生微生物种群是动态变化的，受气候特征、温度、植物种类、植物生育期等外界环境的影响。附生微生物中除了乳酸菌这类益生菌外，还包括厌氧的梭状芽孢杆菌属（Clostridium），兼性厌氧的泛菌属（Pantoea）［7］，需氧的芽孢杆菌属（Bacillus），蓝细菌（cyanobacteria）和大肠菌群（coliform bacilli）［7-9］。好氧性细菌和大肠杆菌的数量多，而有益的乳酸菌含量较低。

张志霞等［10］发现青藏高原小麦（Triticum aestivum）茎叶和根际土壤中主要是大肠杆菌（105～109CFU/g）和好氧性细菌（106～109CFU/g）；乳酸菌含量较低（102～108CFU/g），这些乳酸菌主要来自于乳杆菌属（Lactobacillus）的植物乳球菌（L. plantarum）；乳球菌属（Latococcus）的格氏乳球菌（L. garvieae）；链球菌属 （Streptococcus） 的假肺炎链球菌 （S. pseudopneumoniae）、明串珠菌属（Leuconostoc）的肠膜明串珠菌（L. mesenteroidessubsp.mesenteroides）、霍氏明串珠菌（L.holzapfelii）和乳酸明串珠菌（L.lactis）、片球菌属（Pediococcus）的戊糖片球菌（P.pentosaceus）以及肠球菌属（Enterococcus）的鸡肠球菌（E. gallinarum）和蒙氏肠球菌（E. mundtii），其中球菌占绝大多数。

Müller 等［9］发现德国东北部低地的广阔草原地区草地植物表面附生乳酸菌主要包括：乳酸杆菌属（Lactobacillus） 的L. plantarum，L. brevis，L. casei，L.rhamnosus，L. curvatus，L. gasseri和L. pentosus，总量不超过1×103CFU/g；片球菌属（Pediococcus）的戊糖片球菌（P.pentosaceus），乳酸菌片球菌（P.acidilactici），P.damnosus，总量也不超过1×103CFU/g；附生乳酸菌中还有少量的肠球菌属（Enterococcus）的粪肠球菌（E. faecalis），蒙氏肠球菌（E. mundtii），铅黄肠球菌（E. casseliflavus），屎肠球菌（E. faecium）和硫磺肠球菌（E.sulfureus），肠球菌间具有一定的拮抗作用［11］；这些菌株均对万古霉素（vancomycin）敏感，但几乎所有菌株对庆大霉素（gentamycin） 和链霉素（streptomycin） 均耐药［9］。

Yang 等［7］在南方地区新鲜紫花苜蓿中分离到附生乳酸菌主要包括乳杆菌（Lactobacillus），乳球菌（Lactococcus）和魏斯氏菌（Weissella）。郭琳娜等［12］在上海地区35 个紫花苜蓿（Medicago sativa）品种中筛选出低可溶糖环境下，能于24 h 内将培养基pH 值降至4.0 以下的产酸能力强的戊糖片球菌（Pediocoecu spenlosaceus），该菌对李斯特菌属（Listeria）的抑菌率达77.61%，而对大肠杆菌（Escherichia coli）和沙门氏菌属（Salmonella）的抑菌率分别为65.67%和13.70%。

中国北方牧场青贮玉米表面附生乳酸菌含量低，以乳酸乳球菌（Lactococcus lactissubsp.Cremoris）、韩国魏斯氏球菌（Weissella koreensis） 和布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）等为主［13］。中国南方地区优质玉米青贮 （pH 值＜4.2 和 36.26～79.83 mg/g DM 乳酸含量） 的饲料原料表面附生细菌主要以魏氏菌（Weissella） 为主［14］。

综合来看，目前已知植物附生乳酸菌包括：乳酸杆菌（Lactobacillus）、明串珠球菌（Leuconostoc）、乳酸球菌（Lactococcus）、链球菌（Streptococcus）、肠球菌属（Enterococcus）、片球菌（Pediococcus）和魏斯氏球菌（Weissella），其中片球菌（Pediococcus）和明串珠球菌（Leuconostoc）是其中优势的产乳酸球菌。南方地区植物附生乳酸菌中魏斯氏球菌（Weissella）含量较丰富。所有附生乳酸菌中同型发酵乳酸菌量较低。植物原料附生乳酸菌种类、数量及其生理生化特性是影响青贮发酵的重要因素。如果消除外源微生物，添加外源乳酸菌可以获得更优质的青贮发酵品质［7］；但这似乎在生产中不可能实现。因此，研究植物附生乳酸菌菌群及其特性可明确青贮生产中适宜类型乳酸菌的选择。

表1 植物附生乳酸菌和青贮饲料中乳酸菌明细Table 1 Lists of epiphytic Lactobacillus and Lactobacillus in silage

续表

3 青贮饲料乳酸菌种群分布

青贮饲料中乳酸菌种类较丰富，不同地区、不同青贮原料的青贮饲料中乳酸菌种群结构和数量差异较大。保安安等［15］对青藏高原垂穗披碱草（Elymus nutans）青贮饲料中乳酸菌多样性研究的结果表明，垂穗披碱草青贮饲料中共分离得到108个乳酸菌菌株，分属于6 个属，18 个种。其中乳杆菌属50 株，明串珠菌属39 株，魏斯氏菌属7 株，肠球菌属6 株，片球菌属 3 株和乳球菌属 3 株。Pang 等［16］研究发现玉米青贮后主要乳酸菌包括食窦魏斯氏菌（Weissellacibaria）（8.5%），戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）（16.9%），假肠膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides）（8.5%），植物乳杆菌（L. plantarum subsp.plantarum）（57.6%） 和蒙氏肠球菌 （E. mundtii）（8.5%）。Xu等［17］发现全株玉米青贮饲料中98%的乳酸菌是乳杆菌（Lactobacillus），包括耐酸乳杆菌（L. acetotolerans）、青贮饲料乳杆菌（L. silagei）、类谷糠乳杆菌（L.parafarraginis）、布氏乳杆菌（L.buchneri） 和臭豆腐乳杆菌 （L.odoratitofui）。Pang等［18］还发现高梁和饲用水稻青贮中主要乳酸菌是植物乳杆菌（L. plantarum）；苜蓿青贮中主要是假肠膜明串珠菌（L. pseudomesenteroides），植物乳杆菌（L. plantarum）和类植物乳杆菌（L.paraplantarum）；不过苜蓿青贮的品质较差。马召稳等［19］报道苜蓿青贮饲料中乳酸菌主要有：乳杆菌属的植物乳杆菌及短乳杆菌（L. brevis）；乳球菌属 （Lactococcus） 的乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）；片球菌属（Pediococcus）的乳酸片球菌（P. acidilactici）和肠球菌属（Enterococcus）的粪肠球菌（E. faecalis）和屎肠球菌（E. faecium）。

西南高温高湿地带玉米和杂交象草青贮料中的乳酸菌以乳酸杆菌属、片球菌属（Pediococcus）和魏斯氏菌属（Weissella）为主，其中植物乳杆菌（L.plantarum）、鼠李糖乳杆菌（L. rhamnosus）和副干酪乳杆菌（L. paracasei）是优势菌株；戊糖片球菌（P.pentosaceus）、乳酸菌片球菌（P.acidilactici）、谷糠乳杆菌（L.farraginis）、唾液乳杆菌（L.salivarius）、食窦魏斯氏菌（Weissella cibaria） 和类肠膜魏斯氏菌（W.paramesenteroides） 也有分布［20］。

目前在青贮饲料中发现的乳酸菌主要分布在厚壁菌门芽胞杆菌纲芽胞杆菌目，主要包括7 个属：乳杆菌属（Lactobacillus）、片球菌属（Pediococcus）、明串珠菌属（Leuconostoc）、肠球菌属（Enterococcus）、乳球菌属（Lactococcus）、链球菌属（Streptococcus）和魏斯特氏菌属（Weissella）。其中乳酸杆属、明串珠菌属、片球菌属和链球菌属是核心乳酸菌成员。

4 乳酸菌对青贮饲料品质的影响

青贮调制过程中添加适宜的乳酸菌制剂对提高青贮发酵品质、营养品质以及有氧稳定性等至关重要，生产实践中乳酸菌接种剂的添加效果受菌种类型、接种量、青贮原料中水溶性碳水化合物含量等多种因素的影响。外源添加适宜的同型乳酸菌可以产生较多的乳酸，降低环境pH 值，达到缩短发酵时间，抑制不良微生物活动，从而提高青贮发酵品质；外源添加异型乳酸菌可以产生乳酸和挥发性脂肪酸，抑制好氧细菌的生长，提高青贮饲料的有氧稳定性；另外还有一些具有纤维素酶活性的乳酸菌具有提高青贮饲料纤维品质作用。目前大多数商品接种剂以兼性异型发酵乳酸菌为主，包括兼性异型发酵乳酸菌：植物乳杆菌（L. plantarum）、屎肠球菌（E. faecium）、乳酸片球菌（P. acidilactic）和戊糖片球菌（P.pentosaceus）；专性同型乳酸菌嗜酸乳杆菌（L. acidophilus） 和专性异型乳酸菌布氏乳杆菌（L.buchneri）［6］。

4.1 乳酸菌对青贮发酵品质和营养品质的影响

乳酸菌对青贮发酵品质的改善作用主要表现在产生乳酸，提高乳酸发酵速度。王洋［21］发现添加不同乳酸菌在一定程度上可提高苜蓿青贮发酵品质。也有研究发现乳酸菌和其他添加剂混合添加的青贮发酵效果更好。Hashemzadeh-Cigari［22］和赵庆杰［23］均发现，与单独添加乳酸菌制剂组相比，乳酸菌制剂+糖蜜组显著提高了青贮发酵品质。Ke 等［24］研究发现混合添加果酸和植物乳酸菌或者柠檬酸和植物乳杆菌均可以有效降低苜蓿青贮中非蛋白氮的产生，而且果酸添加还有助于抑制青贮苜蓿中的脂肪酸的生物氢化（biohydrogenation，BH）。

4.2 乳酸菌对青贮有氧稳定性的影响

青贮过程中或青贮饲料饲喂过程中，一旦氧气进入，酵母菌作为青贮饲料有氧腐败的启动者，利用糖类和发酵产生的酸类进行快速生长繁殖，导致pH 值升高，随后其他好氧杂菌（霉菌、梭菌等）生长，发生化学反应，同时乳酸含量下降，pH 值进一步上升，产生二氧化碳、水和氨，导致青贮饲料的质量和消化性能降低［25］。青贮中接种异型发酵乳酸菌或兼性异型乳酸菌可产生乙酸或者1，2-丙二醇，1，2-丙二醇进一步代谢为丙醇和丙酸，乙酸和丙酸通过抑制腐败菌，改善青贮好氧稳定性，如布氏乳杆菌（L. buchneri）、希氏乳杆菌（L.hilgardii）和类谷糠乳杆菌（L.parafarraginis）、短乳杆菌（L. brevis）和屎肠球菌（E.faecium）等，在青贮发酵中发挥着增加有氧稳定性的作用［26-32］。Zielińska 等［30］发现兼性异型乳酸菌Lactobacillus buchneriAKKP 2047p能够将1，2-丙二醇代谢成丙酸，并且葡萄糖和钴胺素对其代谢有促进作用。不同发酵类型的乳酸菌符合使用对有氧稳定性亦有积极作用，如塔娜等［33］发现布氏乳杆菌单独或与蒙氏肠球菌和植物乳杆菌联合接种均可有效抑制无芒雀麦青贮的有氧腐败，保证无芒雀麦青贮有氧暴露期间品质的稳定，且前者更有效。

乳酸菌和纤维素酶或其他物质混合后添加或可影响青贮饲料的有氧稳定性。籽粒苋（Amaranthus hypochondriaus）和水稻秸秆混合青贮中同时添加乳酸菌和纤维素酶的处理和不添加的空白对照相较单独添加乳酸菌或纤维素酶的处理组更易于发生有氧腐败［34］。

5 研究展望

以乳酸菌发酵为主的青贮饲料除了为家畜提供优质的能量、蛋白等营养外，还可在青贮过程中产生少量或者微量的功能性代谢产物，如乳酸、乙酸、甲酸、邻苯二酚、3-苯乳酸、4-羟基苯甲酸、壬二酸、3,4-二羟基苯甲酸、4-羟基肉桂酸、邻苯二酚、邻苯三酚和阿魏酸等具有抗菌活性或抗氧化作用；乳酸菌胞外多糖（exopolysaccharide，EPS），乳酸菌素（lactocidon）、嗜酸乳菌素（acidolin）、嗜酸杆菌素（acidophilin）、乳酸链球菌素 （nisin） 等细菌素（Bacteriocin）；非蛋白质功能性氨基酸γ-氨基丁酸（γaminobutanoic acid，GABA）等。这些物质除了可以提高青贮饲料发酵品质和有氧稳定性外，还发挥着抑制不耐酸的有害微生物生长和繁殖、降解饲料中真菌毒素，调节家畜非特异性免疫力、改善肠道功能等益生作用［17，35-37］。

随着我国畜牧业健康发展的不断推进，特别是近年来抗生素逐渐退出养殖业，青贮饲料因其营养作用和特殊的生理功能，已经逐渐从草食家畜养殖向单胃家畜养猪渗透［38］。近年来各类测序技术和组学技术的不断丰富完善，对青贮原料、青贮过程中乳酸菌及其他微生物种群动态变化研究及新菌株的开发提供了便利。青贮研究今后应继续加强不同青贮原料以及混合青贮的发酵机理、微生物动态变化，以及在动物生产性能、动物疾病等方面的调控作用等方面的研究，为青贮饲料产业化发展奠定科学基础。