铜基纳米颗粒在农药领域的潜在应用

董欣欣, 姬彦飞, 田 野, 张 杰, 刘成伟

(东北林业大学 生命科学学院，东北盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室，哈尔滨 150040)

0 铜基纳米颗粒概述

铜 (Cu) 是一种具有优良传导性与延展性的金属，在工业上有着极为广泛的应用。近年来，纳米颗粒 (nanoparticles，NPs) 因其独特的性能而越来越受到人们重视，铜基纳米颗粒更是较为广泛应用的纳米金属材料。

与传统铜剂相比，铜基纳米颗粒具有体积小、比表面积大、活化能高、活性位点多等诸多优良的独特性能，使得其在许多领域都有着极为广泛的应用潜力[1]。铜基纳米颗粒可用作某些反应的催化剂，由于纳米粒子的比表面积较大，因而与传统铜金属材料相比能取得更好的催化效果[2]。铜基纳米颗粒具备一定的荧光性能，在与某些特定物质接触后可特异性地发生荧光猝灭，因而可利用该荧光特性进行某些物质的检测或环境监测[3]。铜基纳米颗粒的荧光特性还可用于生物探针的制备，将其与特定序列的DNA 模板等生物材料相结合，制备成新型生物荧光探针或检测材料，可对特定序列进行标记，从而通过荧光的有无及强弱对生物材料进行原位标记与含量测算[4]。此外，铜基纳米颗粒因其独特的理化性质与生理毒性，在农药学领域也有着广泛的应用潜力[5]。

铜剂在农药领域的应用由来已久。铜离子可以抑制细菌与真菌的生长，含铜农药也已成为农业上应用广泛的抑菌剂之一[6]。常见的含铜农药有波尔多液 (bordeaux mixture)、氧氯化铜 (copper oxychloride)、氧化亚铜 (cuprous oxide)、噻菌铜(thiediazole copper)、松脂酸铜 (resin acid copper salt) 及喹啉铜 (copper 8-quinolinolate) 等，总体可分为无机铜农药与有机铜农药[7-8]。在农业生产实践中，传统含铜农药因具有一些难以避免的缺陷(如无机铜剂易变性及产生药害，有机铜剂对人畜具有较高的毒性与危险性等)，且长期以来农药的使用造成了大量耐药菌的出现，因而急需开展新型农药制剂的研究开发[9]。

与传统铜制剂相比，铜基纳米颗粒具有完全不同的作用机制[10]，因而适用于更广泛的应用场景，可考虑用于植物生长调节剂、抑菌剂及除草剂等诸多方面。

1 铜基纳米颗粒作用机理

1.1 营养补足

铜元素在植物中普遍存在，是植物生存必不可少的微量元素之一[11]。铜元素参与了植物中多种氧化还原酶类的构成，这些酶类与植物的正常代谢及抗逆性能息息相关。在诸如抗坏血酸氧化酶、漆酶等的铜氧化酶结构中，铜离子起着活性中心的作用。在酶促反应中，电子可由底物传递至铜离子中心发生氧化还原反应，最终生成水分子。植物的多种生命活动与代谢途径都离不开含铜酶类的参与，含铜酶类在植物的愈伤、发育及生殖等进程中均扮演着重要的角色[12]。当铜元素缺乏时，植物的各项生理活动进程均可被阻滞，并可发生叶片萎黄、木质发育不良等状况，甚至可能导致植株生长阻滞或死亡[13]。

Nasrollahzadeh 等[14]报道，施用金属纳米颗粒可以有效提高植物中对应元素的含量。将铜基纳米颗粒制成悬液进行喷施，可以起到补足植物所缺铜素的作用。纳米颗粒可经由植物根系及叶片气孔等进入植物体内，并通过各种转运机制运抵植物全株[15]。

1.2 氧化应激与膜崩解

经较高浓度的铜剂处理后，生物体内会迅速形成大量自由基，当所产生自由基的量超出细胞内抗氧化物的平衡能力时，就会导致细胞产生各种氧化损伤[16]。图1 展示了铜基纳米颗粒对植物病原菌 (以真菌为例) 的损伤作用。

Chatterjee 等[17]指出，由铜基纳米颗粒介导的细胞膜电位耗散与大量活性氧等自由基对膜脂及细胞成分的破坏可能是其主要的毒性作用机理。在纳米颗粒诱导下，细胞内膜结构的跨膜质子动力被阻断，造成膜电位显著下降，并由此造成细胞骨架蛋白分布的改变，导致膜通透性改变与功能丧失，甚至崩解。Banik 等[18]在其研究中也发现，铜基纳米颗粒会造成胞内氧化状态的失衡，由于细胞内酚类物质、脯氨酸、谷胱甘肽等不足以调控其氧化水平，导致大量膜脂及蛋白被破坏形成丙二醛等小分子物质，使得细胞膜出现崩解及渗漏，从而引起内容物流出。

Wang 等[19]解析了铜剂处理后细胞代谢物成分的变化，发现胞内磷脂酰乙醇胺及磷脂酰胆碱等物质的量明显减少，而磷脂酰甘油和单半乳糖基二酰基甘油等物质的量则显著增加，这些物质的变化可能与胞内的膜脂过氧化有关。此外，氧化应激还会引起胞内谷胱甘肽代谢紊乱及渗透调节因子积累异常等。

铜基纳米颗粒可能通过扩散内化或经由细胞的内吞作用进入胞内，并在纳米颗粒表面或胞内溶解的铜离子附近产生活性氧[20]。纳米颗粒可通过导致胞内抗氧化酶失活而造成大量内源性过氧化氢释放，也可通过阻断线粒体电子传递链而产生大量超氧化物[21]。胞内活性氧的产生不仅会对细胞膜造成氧化损伤，还会对核内DNA 分子及相关蛋白造成不可逆破坏[22]，从而致使细胞生长阻滞或死亡。此外有研究表明，即便在活性氧生成较少的情况下，纳米颗粒仍可通过与特定膜结构及特定蛋白的结合来阻碍基因表达，造成细胞某些基因表达量的显著下调，从而严重干预细胞的各项代谢水平与生理功能[23]。

1.3 诱导系统抗性

诱导性系统抗性 (induced systemic resistance，ISR) 是植物在受到环境胁迫或遭受侵染性病害时产生的一系列防御机制，经由一些特定基因的激活与代谢途径的产生，总体表现为抗氧化酶活性或非酶类抗氧化剂含量等的升高[24]。

铜基纳米颗粒的施用，可“模拟”真实病害或逆境胁迫时的氧化损伤，从而激发植物的诱导性系统抗性，因而可提升植物的抗逆能力及活性成分含量[25]。植物的系统抗性主要表现为特定抗性基因表达量的显著提升，从而引发特定抗氧化酶活性提高，以及非酶抗氧化剂及角质、蜡质、类黄酮等次生代谢产物含量的增长[26]，而这些变化都与植物的抗病能力息息相关，也将显著提高植物对环境胁迫的应对能力。

2 铜基纳米颗粒应用类型

2.1 用作植物生长调节剂

金属纳米颗粒对植物的影响与植物品种及纳米颗粒形态、浓度、施用方式等因素均有关系[27]。在合理的施用条件下，铜基纳米颗粒可显著增加植物的矿质营养，并促进植物生长、提高果实品质[28]。根据这些性质，可将铜基纳米颗粒用作植物生长调节剂。

Hafeez 等[29]采用纳米铜 (Cu NPs) 悬液处理小麦，发现小麦干重等生长参数明显增加，并检测到了叶绿素含量的升高。Hernández-Hernández 等[30]的研究证明了纳米铜与纳米硒在适宜浓度与配比时对番茄果实产量增加与品质提升的作用，并发现叶片与果实中的抗氧化物质含量也均有不同程度升高，而该指标标志着番茄植株的抗病性能有所增强；此外，喷施适宜浓度与配比的纳米铜和纳米硒后，番茄果实中的抗坏血酸、谷胱甘肽及类黄酮等活性物质的含量也均高于对照组。Choudhary等[31]将铜基纳米颗粒与壳聚糖制成混合营养剂，用于玉米植株上喷雾施用，不仅提高了玉米的生长参数，还提升了玉米植株对弯孢菌叶斑病的抵御能力。

Zhao 等[32]在其研究中证实，铜基纳米颗粒喷施后可被植物根部直接吸收，经由一个由含硫蛋白构成的转运结构传输至叶片等各个部位，并可在相关酶的作用下将铜基纳米颗粒转化为铜盐加以吸收利用。将铜基纳米颗粒作为药物载体与其他营养补充剂结合，不仅可诱导植物的系统抗性，还可为其提供营养补充，从而起到更好地调节植物生长的作用[33]。

2.2 用作抑菌剂

铜基纳米颗粒可引起细胞的氧化损伤，并可介导膜崩解，因而可用于植物病原菌的防控，在农业中作为杀菌剂加以利用。近年来将铜基纳米颗粒用作杀菌剂防控植物病害的相关研究见表1。

表1 采用铜基纳米颗粒抑制植物病原菌的相关研究Table1 Research on inhibition of plant disease pathogens using copper-based nanoparticles

从表1 中数据可看出，不同类型铜基纳米颗粒的抗菌活性存在较大差异。Hermida-Montero等[34]曾指出，铜基纳米颗粒的抑菌活性与其晶格、合成路线及粒径等诸多因素有关，同时他们还认为，纳米颗粒的流体力学尺寸可能也与其生物活性等密切相关。流体力学尺寸影响着铜基纳米颗粒与水环境或胞质溶胶的实际接触面积，因而影响着实际释出铜离子的量以及最终可产生自由基的量，而这些因素均与铜基纳米颗粒的抑菌性能密切相关。铜基纳米颗粒的抑菌作用不依赖代谢通路，因而具有广谱性，在多种病原菌的防治中均具有较好的应用前景[35-36]。

此外也有研究尝试将铜基纳米颗粒与农业生产中的某些抗菌药物联用，探究其联用对防治效果的影响。结果表明，添加铜基纳米颗粒可显著提高抗真菌药物的效果，从而减少传统化学药剂的使用，降低对环境的污染，同时可取得更好的防效，对农业生产中植物病虫害的防治具有积极意义[37]。Malandrakis 等[41]将纳米铜颗粒与甲基硫菌灵 (thiophanate-methyl)、氟啶胺 (fluazinam)等传统抗真菌药剂联用，对15 种耐药性灰葡萄孢Botrytis cinerea 进行抑菌活性试验。结果表明，纳米铜颗粒极大地提升了传统抗真菌药剂的抑菌活性，将其与推荐剂量1/50 的甲基硫菌灵联用，仍可保证较好的杀菌效果。此外，作者进一步研究发现，大量耐多种药剂的灰葡萄孢菌株的耐药性与其线粒体cytb 基因的G143A 抗性突变有关，该位点的突变使得经由三磷酸腺苷 (ATP) 代谢途径发挥抗菌效果的杀菌剂纷纷失效，而添加纳米铜颗粒后则可对这些耐药菌产生良好的杀灭效果，因而推测纳米铜颗粒的杀菌效果可能与破坏植物病原菌的ATP 代谢通路有关。铜基纳米颗粒被菌体吸收后虽然会破坏菌体的生理结构，但却会增强其转运系统，从而使得铜在菌体结构间的转移性能得到增强，有利于高效发挥铜基纳米颗粒的抑菌作用[42]。此外有研究证实，在低于最小抑菌浓度下，铜基纳米颗粒仍可通过破坏真菌的菌丝结构而减少甚至完全阻止真菌毒素的产生，这在农业生产与农产品存储方面具有十分重要的价值，值得研究者注意[39]。真菌毒素是难以消除的小分子有机物，对人畜具有广谱的致癌作用，是农产品储存的一大难题，若能将铜基纳米颗粒制成能够有效抑制真菌毒素产生的抑菌剂型，将极大地提高仓储农产品的安全性。

此外，铜基纳米颗粒对植物上的细菌性病害也有一定的防治能力。已有研究证实，铜基纳米颗粒对植物软腐病[43]、叶枯病[44]、青枯病[45]及斑点病[46]等侵染性细菌病害均有较好的防治效果。氧化应激与活性氧的产生也是铜基纳米颗粒对细菌细胞造成杀伤效果的主要机制[38]。铜基纳米颗粒对革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌均具有较好的杀灭能力，在进入胞内后可显著抑制其抗氧化酶的活性，并对细菌质膜的稳定性构成威胁[47]。Shuai 等[48]的研究也证实，纳米颗粒具有损伤细菌细胞膜结构及改变其通透性的能力。Noman等[49]在其研究中进一步发现，铜基纳米颗粒不仅会破坏细菌细胞膜的结构，还可对其细胞壁结构造成不可逆损伤：铜基纳米颗粒可通过产生活性氧等自由基破坏细胞壁成分中各官能团的C–C 键，造成细胞壁上碳水化合物与氨基等结构的降解，从而导致菌体生理功能丧失与细胞成活力降低，并最终导致菌体死亡。

铜基纳米颗粒虽然具有良好的抗菌活性，但其可能带来的环境污染问题也在一定程度上制约了其应用和发展。由于铜基纳米颗粒对环境的危害程度与其成分、浓度、粒径以及表面有无包覆剂等因素相关，因而可以通过包埋、交联等手段改变其组成或表面结构，从而减少潜在危害，提高其生物利用率[50]。Halbus 等[51]采用三甲氧基硅烷和4-羟基苯基硼酸对氧化铜纳米颗粒进行交联，从而显著增强了氧化铜纳米颗粒对植物病原菌的损伤能力，降低了使用浓度，提高了抑菌效率并可减轻对环境的威胁。这是由于交联后所形成的复合物表面的硼酸基团可与细菌表面的糖蛋白共价结合，从而有效提高了其对病原菌细胞的亲和力。此外，壳聚糖[52]、柠檬酸三钠[53]等均可用于铜基纳米颗粒的包埋。经过包埋等方式处理后，纳米颗粒对病原菌细胞的渗透能力显著提升，其抗菌能力也随之增强，同时对植物造成损伤的可能性随之减弱。

2.3 用作除草剂

金属纳米颗粒对植物细胞结构也具有一定的破坏作用[54]。与众多其他重金属微量元素一样，在浓度较高时，过量的铜元素会对植物造成严重损伤[55]。高浓度的铜离子会对植物细胞中的膜结构造成损伤，改变膜蛋白活性与膜的通透性，造成膜功能丧失，使得依赖于膜功能的光合作用等特定代谢途径发生异常，进而导致植株营养积累阻碍[56]。

铜元素在植物中参与了部分特定氧化还原酶类及某些光合色素的合成，因而过量的铜被植物吸收后，会经由PAA1、HMA6 等铜转运蛋白定向转移至叶绿体中[57]，并会首先在叶绿体处产生大量的活性氧自由基，从而导致叶绿体产生氧化损伤 (图2)。针对此特性，可采用铜基纳米颗粒制备新型除草剂，用以消除杂草等特定植物，或清除水域中的藻类污染。

铜基纳米颗粒对植物绿色细胞的损害类型主要是氧化损伤。被植物吸收的铜基纳米颗粒能转化为多种离子形态，在植物细胞各个部位特别是膜结构附近产生大量自由基，对植物的代谢及光合作用等产生强烈的抑制作用，阻碍某些代谢中间体的积累，降低植物的呼吸速率，从而抑制植物生长，甚至造成植株死亡[58]。Adhikari 等[59]的研究表明，过量摄入的Cu2+会取代叶绿素光反应中心的Mg2+，从而损害光合反应的正常进行，此外铜基纳米颗粒还会抑制类胡萝卜素的形成，进一步损伤细胞的抗氧化能力，使得其更易受到纳米颗粒的损害。

目前已有研究者利用铜基纳米颗粒对某些植物的特定毒理作用而将其用作除草剂，用于清除田间杂草或造成水域污染的浮游植物。傅凤等[60]研究了纳米铜颗粒对4 种常见水生藻类的抑制活性，发现其在较低质量浓度 (2.0 mg/L) 下即可显著抑制4 种水生微藻的生长，因而可作为治理水华的理想药剂。Müller 等[61]采用纳米铜颗粒处理莱茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii，取得了较好的杀灭效果，并认为其对该单细胞藻类的杀灭作用主要经由Cu2+的释放而实现。Perreault 等[62]采用聚合物包覆的氧化铜纳米颗粒抑制莱茵衣藻的生长，与无包覆的氧化铜纳米颗粒相比取得了更好的效果。此外，氧化铜纳米颗粒还可通过强烈的膜崩解作用而对水体中的蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa 起到杀伤作用[63]。因而可将铜基纳米颗粒用于湖面等密闭水域污染的治理，可有效抑制浮游植物的生长[64]，从而遏制水华等水域污染现象，有利于良好水域生态的建立[65]。

3 展望

铜不仅是植物生长必不可少的重要微量元素，同时也是极易造成环境污染的重金属元素之一。铜基纳米颗粒所具有的诸多独特性质，使得其在农药领域具备了广阔的应用前景。目前铜基纳米颗粒的制备方法大致可分为化学法与生物法。化学法总体又可分为固相法、液相法和气相法等，其中液相法具有易操作、工艺流程短及工业化生产成本低等优势，是目前主要的工业生产方法[66]。近年来铜基纳米颗粒的生物合成已越来越受到瞩目，现有研究证实，包括细菌、真菌、藻类、植物等在内的多种生物系统均可用于铜基纳米颗粒的合成。与化学合成相比，铜基纳米颗粒的生物合成方法具有污染低、产物生物相容性好等特点，在实际应用中具备一定的独特优势[67]。采用生物法合成的纳米颗粒外表通常被有机物包覆，这些有机物质的存在对其生物相容性起着决定性的作用，同时还可起到缓释铜离子的作用。此外，与化学法相比，生物法合成的铜基纳米颗粒具有更好的分散性能与热稳定性[68]，这对于其实际应用效果极为关键。

少剂量的铜剂可以有效提高植物的铜素营养，并可从多种途径增进植物的代谢速率。此外，由适量铜剂刺激引发的诱导性系统抗性也是植物抗逆性能的关键。这些机制都有利于提高植物的营养吸收、生长参数以及对不良环境条件的耐受能力。目前将铜基纳米颗粒用作植物生长调节剂时常需与传统营养剂搭配使用，从而提高植物的铜耐受能力，并起到促进植物生长的效果。此外，可以采用包埋等方法处理铜基纳米材料以实现缓释效果，从而在发挥铜剂植物生长调节剂功能的同时避免其快速摄入而对植株造成损害。

铜基纳米颗粒对植物病害病原菌可起到良好的抑制或杀灭作用，其主要作用机理是所引发的氧化应激与膜崩解作用[69]，此外其所诱发的活性氧生成与胞内氧化应激反应的产生也是其毒理特性的重要因素之一[70]。这些活性氧的生成不仅会对细胞结构造成破坏，还会导致DNA 降解，对细胞的遗传物质与遗传结构造成不可逆损伤[71]。铜基纳米颗粒在抑菌方面具备较好的应用潜力，其与传统农药抑菌机理不同，有可能取得更为优异的抑菌效果，并可减少化学农药生产及使用过程中可能产生的环境污染。考虑到铜基纳米颗粒对植物的毒害作用与可能引发的铜素富集问题，当前一般将其与传统抑菌农药共同使用而非单独施用。在与传统农药共同使用时，铜基纳米颗粒可以显著提高传统农药的防治效果，并可对传统农药难以杀灭的耐药菌产生较好的防治效果[41]。考虑到铜基纳米颗粒的毒性，在制备时可采用包埋技术以实现缓释效果，并应考虑植株的耐铜能力选用不同的施用方式，以避免对植株产生药害。

铜基纳米颗粒的抑菌效果及对环境的影响与其成分、粒径和表面结构等息息相关。目前广受瞩目的研究方向是如何尽可能缩小铜基纳米颗粒的尺寸以提高药效，并使用包埋等技术手段减轻其对环境的威胁。以往研究中通常使用壳聚糖等物质进行包覆，或采用生物法进行合成。近年来使用金属有机框架 (metal-organic frameworks，MOFs) 进行农药负载的研究已逐渐成为热点，与传统载体相比，MOFs 具有吸附能力强、孔径可调等特点[72]，在农药负载方面具有较好的应用前景[73]。而铜基MOFs 本身便具有一定的抑菌能力[74]，因而在用于农药负载时有望对药效起到增强作用。有研究指出，根际有益微生物的存在可以通过多种机制提高植物的铜耐受能力[75-76]，因此在实际应用中可将铜基纳米颗粒与有机菌剂复合施用。

利用铜基纳米材料的毒理学作用可以实现植被的清理与水域的净化。现有研究证实，铜基纳米颗粒对植物组织的毒性作用具有种属特异性，即不同种植物对铜剂的耐受能力不同[77]，因而可通过相关毒理学试验，探索能够有效杀灭杂草并尽可能减少对作物造成药害的最佳浓度，从而制成与传统除草剂相比环境危害较小的新型无机广谱除草剂。此外，水华、赤潮是严重威胁水产养殖业的生态灾害，具有发展迅速、难以预测等特点，往往会对水产业造成严重损失。研究表明，铜基纳米颗粒在较低浓度时即可有效杀灭水域中的浮游藻类，这为水华、赤潮的防治提供了一个新的有效解决方案[78]。当然，铜剂本身的潜在环境毒性也是一个不容忽视的问题。铜元素的大量存在会改变环境中各种生物的生理状态，并可造成植株营养成分流失、活性产物减少等问题[79-80]。铜素污染不仅会对喷施地的生态造成威胁，还会渗入地下水、汇入河流甚至海洋，从而对更广阔区域的生态造成潜在毒性[81]。因而，如何在环境中安全高效地使用铜剂，仍是一个值得深入研究的问题。

总之，铜基纳米颗粒是工业上较常制备与应用的金属纳米材料，因其特殊的理化性质与毒理特征，可在农药领域得到广泛开发应用。如用于提高植物的抗病能力，促进营养吸收，减少各种生物灾害对农业生产的影响，从而有效提高农作物产量。而利用其广谱抑菌特性，则可有效减少传统化学农药的使用，在取得良好抑菌效果的同时减轻化学农药生产和使用过程中对自然生态环境的破坏。由于纳米金属材料固有的生理毒性，其在农业生产中的应用仍存在一些问题，但随着相关机制的阐明与剂型的改进，相信铜基纳米颗粒一定可以为新型农业、环保农业的发展中成功助力。