循环microRNA-223水平与急性冠脉综合征患者的血小板反应及临床预后相关性的研究

张莹莹，郭绪昆，郑君毅，刘婷，张莹，马静，刘寅

阿司匹林联合血小板P2Y12受体拮抗剂氯吡格雷的双联抗血小板聚集治疗（dual antiplatelet therapy，DAPT）在心血管疾病的抗栓治疗中发挥了重 要 的 作 用［1］，但 氯 吡 格 雷 抵 抗（Clopidogrel resistance，CR）的临床现象不断被报道［2］，与治疗后血小板高反应（high on−treatment platelet reactivity，HTPR）相关的血栓事件也不可避免［3］。有研究表明，药物相互作用［4］、肝脏细胞色素P4502C19（CYP2C19）基因多态性［5−6］、合并糖尿病［7］、吸烟［8］等多种因素均与CR相关。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类大约由22个碱基构成的短链RNA，能靶向结合mRNA的3'非编码区（UTR）于转录后水平调节mRNA的表达。miRNA异常表达与包括心血管疾病在内的多种疾病相关［9］。Landry等［10］首次报道血小板富含大量的miRNA，其中miR-223、let-7c和miR-19a的含量较为丰富；编码血小板重要受体P2Y12mRNA的3'UTR存在miR-223的结合位点，并发现了两者相结合的证据。血小板P2Y12受体是氯吡格雷的作用靶点,但CR是否与miR-223的表达水平相关尚不明确。本课题组前期通过定量血小板和血浆miR-223表达水平已经初步证实，血小板反应指数（platelet reactive index，PRI）与miR-223表达水平呈负相关［11−12］。但也有研究报道在健康志愿者行抗血小板聚集治疗会降低miR-223的表达水平［13］。非ST段抬高急性冠脉综合征（NSTE−ACS）为冠心病的重要类型，本研究连续纳入NSTE−ACS并接受经皮冠状动脉介入（PCI）及DAPT的患者为研究对象，旨在进一步明确血浆miR-223表达水平与患者服用氯吡格雷后血小板反应的相关性，并探索miR-223差异表达与患者临床预后的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象连续纳入2016年10月—2017年2月天津市胸科医院心内科收治的接受PCI及DAPT治疗的NSTE−ACS患者208例，其中男119例，女89例，年龄28～80岁，平均（58.5±9.2）岁。NSTE−ACS诊断符合2012年我国《非ST段抬高急性冠脉综合征诊断和治疗指南》［14］。排除标准：（1）肝肾功能严重不良者，合并其他终末期疾病，预期寿命小于1年者。（2）先天性心脏病、心脏瓣膜病、严重充血性心力衰竭（NYAH分级Ⅳ级）或心源性休克者。（3）入院前长期服用氯吡格雷等抗血小板聚集药物，或口服华法林、利伐沙班、达比加群等抗凝药物者。（4）周围血管疾病或周围血管栓塞性疾病者。（5）急性感染、免疫性疾病、肿瘤患者。（6）血液系统疾病，近期有出血倾向或血小板计数（PLT）异常（＜100×109/L或＞450×109/L）者。（7）应用炎症抑制药物，如非甾体类抗炎药、类固醇及阿片类药物。（8）不能完成2年随访者。本研究经本院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集收集入组患者基本资料，包括性别、年龄、高血压史、糖尿病史、吸烟史、体质量指数（BMI）、质子泵抑制剂（PPI）和他汀类用药史等。患者于入院当天行DAPT，口服300 mg氯吡格雷和300 mg阿司匹林，于次日清晨采集肘正中静脉血约12 mL分别用于血浆miR-223定量、血小板功能检测、CYP2C19*2*3基因型鉴定和临床生化指标检测。临床生化指标包括血常规［白细胞计数（WBC）、中性粒细胞比例（N）、淋巴细胞比例（L）、PLT］、丙氨酸转氨酶（ALT，比色法）、天冬氨酸转氨酶（AST，比色法）、尿素氮（BUN，比色法）、肌酐（Cr，酶法）、尿酸（UA，比色法）、总胆固醇（TC，酶比色法）、三酰甘油（TG，比色法）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL−C，酶比色法）、同型半胱氨酸（Hcy，酶比色法）、高敏C反应蛋白（hs−CRP，速率散射比浊法）、肌钙蛋白I（TnI，化学发光法）、B型尿钠肽（BNP，化学发光法）。

1.2.2 采用实时荧光定量PCR（qPCR）法检测血浆miR-223表达2～3 mL枸橼酸钠抗凝全血，1 000 r/min常温离心10 min，收集上清350μL，转移至无RNase EP管中，加入1 mL RNAiso for Small RNA（TaKaRa，中国大连），按照说明书提取总RNA，反转录为cDNA（One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit，TaKaRa，中国大连），按以下体系进行PCR反应：总体系25μL，SYBR Green master mix 12.5μL，上、下游引物各1μL（TaKaRa，中国大连），cDNA模板1μL，RNase Free dH2O补足至25μL。反应条件：95℃预变性10 min；95℃变性10 s，60℃退火1 min，产物自55～95℃溶解，共45个循环。PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳。以内参基因Human-5srRNA进行标化，采用2−ΔΔCt法计算miR-223的相对表达量。每组设3个复孔，实验重复3次。

1.2.3 血小板功能检测通过流式细胞术测定血小板血管舒张刺激磷蛋白（VASP）磷酸化水平，计算PRI，即VASP−PRI。取枸橼酸钠抗凝全血30μL平均分装至3个抗凝管中，按试剂盒说明书（PLT VASP/P2Y12，BIOCYTEX，法国）操作加样，分别加入前列腺素E1（PGE1）或PGE1+二磷酸腺苷（ADP）。低速振荡混匀，室温孵育10 min，多聚甲醛固定后分别加入抗VASP−P鼠单克隆抗体+破膜剂或阴性同型对照+破膜剂，室温孵育。以CD61−PE进行血小板荧光标记。通过流式细胞仪定量每个样本中ADP抑制VASP磷酸化的能力。根据静息态（PGE1）和激活态（PGEI+ADP）校正的平均荧光强度（MFI）按公式由计算机计算出PRI。

1.2.4 CYP2C19*2/*3基因型鉴定采用Genomic DNA Purification Kit（Promega）试剂盒提取人基因组DNA，按照试剂盒说明书进行操作。PCR反应总体系50μL，2×Taq PCR Master Mix（博迈德生物）25μL，上下游引物各1μL、基因组DNA模板500 ng，RNase Free dH2O补齐总体系至50μL。循环条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环；72℃延伸5 min，使用PCR产物纯化试剂盒（TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.3.0）纯化PCR产物，纯化后的PCR产物分别用相应的限制性内切酶QuickCutSmaⅠ（TaKaRa）、QuickCutBamHⅠ（TaKaRa）消化酶切。酶切后的产物分别进行3%、2%琼脂糖凝胶电泳，电泳结果用GEL DOC2000凝胶成像系统分析。PCR产物经限制性内切酶SmaⅠ消化后，野生型纯合子，在限制性内切酶作用下被切断呈两条带；突变型纯合子，因失去了限制性内切酶的酶切位点，电泳结果呈一条带。呈三条带即为杂合子。PCR产物经限制性内切酶BamHⅠ消化后，琼脂糖凝胶电泳结果，野生型纯合子被切断呈两条带。突变型杂合子，呈三条带，未见突变型纯合子。根据电泳结果可以判断患者是否携带突变基因。引物序列见表1。

1.2.5 SYNTAX评分回顾性分析患者冠状动脉造影病变特点，包括冠状动脉的优势分布、病变部位、狭窄程度与病变特征（开口病变、分叉病变、完全闭塞、病变长度＜20 mm、严重迂曲、严重钙化等），根据SYNTAX评分计算网站www.syntaxscore.com所提供的计算器得出SYNTAX评分［15］。

1.2.6 随访在患者出院后的1、3、6、9、12、18、24个月，对其进行门诊或电话随访，随访终点为主要不良心血管事件（MACE），包括全因死亡、急性心肌梗死、支架内再狭窄、支架内血栓形成。

1.3 统计学方法采用SPSS 20.0和Graphpad prism 6.0统计软件进行统计学分析。计量资料先通过Kolmogorov−SmirnovZ法进行正态性检验，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用独立样本t检验。非正态分布计量资料以M（P25，P75）表示，组间比较采用Mann−WhitneyU检验。计数资料采用例（%）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。血浆miR-223表达水平与PRI的相关性采用Spearman相关分析。通过Cox回归模型检验研究指标对MACE的影响因素。诊断效能判断通过受检者工作特征（ROC）曲线分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基线资料比较根据PRI中位数将患者分为低PRI组（PRI≤56.3%）和高PRI组（PRI＞56.3%），各104例。2组患者年龄、性别、BMI、高血压病史、糖尿病病史、吸烟史、饮酒史、临床生化指标、用药史等差异均无统计学意义；CYP2C19*2/*3基因多态性、冠脉病变SYNTAX评分差异无统计学意义，见表2。

2.2 血浆miR-223表达水平与PRI的相关性低PRI组患者血浆miR-223水平高于高PRI组［（1.15（0.58，1.80）vs.0.64（0.26，1.08），Z=0.471，P＜0.05］。Spearman相关分析显示，血浆miR-223表达水平［0.97（0.34，1.36）］与PRI［（55.93±12.86）%］呈负相关（rs=−0.420，P＜0.05）。

Tab.2 Comparison of basic data between the two groups of patients表2 2组患者基本资料的比较

2.3 NSTE−ACS患者MACE发生风险分析208例患者中30例（14.4%）发生MACE，其中死亡1例，再发急性心肌梗死3例（经冠脉造影均证实为急性支架内血栓形成），26例随访期间复查冠脉造影发现支架内再狭窄，狭窄程度＞50%。低PRI组MACE发生率低于高PRI组（P＜0.05），见表3。

Tab.3 ComparisonofriskanalysisofMACEoccurrencein NSTE-ACS patients between the two groups表3 2组NSTE-ACS患者MACE风险比较［例（%）］

2.4 NSTE−ACS患者发生MACE的危险因素以NSTE−ACS患者随访期间是否发生MACE（是=1，否=0）为因变量，以年龄、性别（男=1，女=0）、吸烟史（是=1，否=0）、hs−CRP、TnI、BNP、携带CYP2C19*2突变基因（是=1，否=0）、携带CYP2C19*3突变基因（是=1，否=0）、SYNTAX评分、miR-223表达、PRI为自变量，进行Cox比例风险回归分析，结果显示，血浆miR-223表达水平高是MACE的独立保护因素，PRI高是MACE的独立危险因素（P＜0.05），见表4。

Tab.4 Cox regression analysis of the risk of MACE in patients with NSTE-ACSs表4 NSTE-ACS患者发生MACE的Cox比例风险回归分析

2.5 血浆miR-223表达水平和PRI预测MACE事件的诊断效能ROC曲线显示，血浆miR-223表达水平和PRI预测MACE的ROC曲线下面积（AUC）分别为0.700（95%CI：0.609～0.791，P＜0.05）和0.710（95%CI：0.606～0.815，P＜0.05），临界值分别为0.99、61.5%，敏感度分别为86.7%、63.3%，特异度分别为50.0%、69.1%，Youden指 数 分 别 为0.37、0.32，见图1、2。

Fig.1 ROC curve for plasma miR-223 in predicting MACE图1 血浆miR-223表达水平预测MACE事件ROC曲线

Fig.2 ROC curve for PRI in predicting MACE图2 PRI预测MACE事件ROC曲线

3 讨论

急性冠状动脉综合征（ACS）是以冠状动脉粥样硬化斑块破裂，继发完全或不完全闭塞性血栓形成为病理基础的一组临床综合征。Zampetaki等［16］于2012年最早提出血浆miR-223表达水平与心血管事件相关。有研究显示血小板P2Y12受体mRNA的3'UTR存在miR-223结合位点，并发现了两者相结合的证据［10］，而P2Y12受体是血小板激活的重要受体，也是氯吡格雷的作用靶点。有研究发现，PLT及血浆miR-223表达水平与PRI呈负相关［11−12］。本研究结果显示，208例NSTE−ACS患者血浆miR-223表达水平与PRI呈负相关，与以往研究结果一致。

ACS患者由于动脉粥样硬化斑块破溃激活血小板，血小板胞浆中的致密颗粒释放ADP作为血小板的次级激活剂。ADP与血小板膜表面的P2Y12受体相互作用，持续激活血小板。氯吡格雷的作用靶点正是P2Y12受体,而VASP是P2Y12下游信号通路产物，可被磷酸化激活。根据上述机制，通过流式细胞术定量检测VASP磷酸化比例，计算VASP−PRI，可评价血小板受抑制的程度。已有多项临床研究表明，根据VASP−PRI定义的HTPR与临床缺血事件相关性良好［3，17−18］。因此,本课题采用VASP−PRI检测方法来定义血小板反应性，PRI的中位数为56.3%。笔者前期小样本探索性研究纳入冠心病患者62例，PRI中位数为55.0%［12］，与本研究结果接近。国外早期研究报道以50%作为CR的诊断标准［2］。一项欧洲的研究纳入486例PCI术后患者，以63.3%作为CR分界标准［19］，可见VASP−PRI的分界标准在世界范围内存在差异，与入选研究对象的种族差异、年龄、性别、疾病构成不同有关，但范围在50%～63%，本研究采用PRI中位数56.3%对患者分组，结果显示，低PRI组患者血浆miR-223表达水平高于高PRI组。

氯吡格雷需经过肝脏细胞色素P450酶代谢转化后才能发挥抗血小板活性作用，而CYP2C19为其中的限速酶，CYP2C19基因突变会影响氯吡格雷的体内激活。CYP2C19等位基因突变可能与氯吡格雷抵抗和缺血性心血管事件增加有关［5−6，20］。因此，本研究检测了亚洲人群中最为常见的2个CYP2C19功能缺失等位基因［21−22］，结果显示，低PRI组与高PRI组CYP2C19*2/*3等位基因携带无明显差异。SYNTAX评分广泛应用于评估冠状动脉病变的严重程度和指导血运重建。本研究结果显示，低PRI组与高PRI组SYNTAX评分亦无明显差异。

有研究报道，新型P2Y12受体拮抗剂替格瑞洛和普拉格雷由于更强的抗血小板聚集作用，较氯吡格雷能进一步降低缺血并发症，已经在高危患者中得到较广泛的应用［19，23］。应用替格瑞洛或普拉格雷的患者血浆miR-223表达水平较应用氯吡格雷的升高，而其PRI较应用氯吡格雷患者降低［24］。以上研究结果进一步证实了miR-223表达水平升高与血小板受抑制程度相关。除此之外，有研究发现，miR-223表达水平与2型糖尿病患者发生缺血性脑卒中有关，miR-223低表达患者更易发生缺血性脑卒中，推测原因是miR-223低表达导致血小板活性增高，进而增加了缺血性脑卒中的风险［25］。结合以往研究，吸烟 史［26］、携带CYP2C19*2/*3突 变 基因［5］、SYNTAX评分［27］、BNP［28］、TnI［29］、hs−CRP［30］是心血管疾病患者发生MACE的影响因素，本研究将年龄、性别、吸烟史、hs−CRP、TnI、BNP、携带CYP2C19*2突变基因、携带CYP2C19*3突变基因、SYNTAX评分、miR-223表达、PRI等指标纳入Cox比例风险回归模型，分析NSTE−ACS患者发生MACE的影响因素，结果显示，血浆miR-223表达水平高是MACE的独立保护因素，PRI高是MACE的独立危险因素。ROC曲线显示，miR-223、PRI预测MACE的AUC≥0.700，诊断价值可靠。

综上所述，循环miR-223表达水平与服用氯吡格雷后ACS患者PRI呈负相关，循环miR-223表达水平和PRI是ACS患者PCI术后发生MACE的独立预测因子。