鲟鱼骨骼发育研究现状及软骨的应用开发

/高丽楠 董颖 胡红霞

鲟鱼是一种古老的软骨硬鳞鱼类，起源于泥盆纪（距今4.5亿年～3.5亿年），是硬骨鱼中最原始的类群和现存最古老的辐鳍鱼类。化石记录显示鲟鱼进化异常缓慢，因此也被称为活化石。依照最新硬骨鱼分类，鲟形目鱼类隶属于硬骨鱼高纲辐鳍鱼纲软质亚纲，软质亚纲目前仅存鲟形目。现存的鲟形目鱼类有27种，呈现不同程度濒危状态，所有鲟鱼均被列入《国际濒危动植物种贸易保护公约》附录II中。

一、鲟鱼骨骼发育的形态学研究

鱼类骨骼包括软骨和硬骨。软骨由软骨细胞、软骨基质和纤维组成。硬骨包括骨细胞、骨间质和纤维。鱼类骨骼都是由原肠胚时期中胚层的间充质细胞发育而成，头部神经嵴细胞发育为头骨，体节中胚层生骨节细胞发育为脊柱与肋骨，侧板中胚层细胞发育为附肢骨骼。鱼类骨骼发育过程中，骨骼骨化包括软骨内骨化和膜内骨化两种模式。软骨内骨化是骨化的主要模式，由间充质细胞先形成透明软骨，随着生长发育，软骨组织逐渐被骨质所替代，最终形成成熟的骨骼。膜内骨化是由间充质细胞先分化为胚性结缔组织膜，然后在此膜内成骨。

鲟鱼的骨骼系统主要分为主轴骨骼和附肢骨骼两部分，主轴骨骼包括头骨、脊柱和肋骨，附肢骨骼包括带骨、支鳍骨骼和鳍条。头骨分为脑颅和咽颅。脑颅由嗅区、眶区、耳区和枕区4个部分组成。咽颅由颌弓、舌弓、鳃弓3个区域组成。鲟鱼脊索呈圆柱形，贯穿全身，位于脊髓的腹面，周围是加厚的脊索鞘，脊索终生存在，没有真正的椎体。肋骨位于躯干部脊柱的两侧，保护内脏器官免受外界伤害，每根肋骨一端与脊柱的横突相连，另一端游离。附肢骨骼能够维持鱼类身体平衡和运动，其中鳍条包括胸鳍、腹鳍、臀鳍、背鳍以及歪形的尾鳍，尾鳍又分为上下两叶，下叶较发达，上叶边缘有一排棘状鳞。鲟鱼还有背、侧、腹五列骨板，其中背骨板一列，侧骨板和腹骨板各两列。

鲟鱼软骨主要有头部脑颅的整块软骨、颚方软骨、米克尔氏软骨、后腭方软骨、关节骨、咽鳃软骨、上鳃软骨、基鳃软骨、脊柱和乌喙部软骨；软硬混合骨主要分布在咽颅和鳍条部位，包括舌颌骨、角舌骨、基舌骨、角鳃软骨、肋骨和鳍条。硬骨主要包括颅骨顶部覆盖的一层较薄的硬骨质膜和头肩部少量骨化结构以及鱼体表面的骨板（图1）。

虽然鲟鱼体中绝大多数骨骼是软骨，但少量硬骨对支撑鱼体、摄食和防御等功能均起到至关重要的作用。颅骨的骨化在早期发育中具有重要的防御作用，通常仔鱼孵化后颅骨骨骼优先发育。在波斯鲟（A.persicus）骨骼系统的发育研究中，12日龄（20.1±1.5mm TL）的仔鱼被首次观察到骨化的骨骼，为上颌骨、齿骨及牙齿。20日龄匙骨、顶骨等骨骼开始骨化。30日龄时，匙骨已完成骨化，而额骨、颊骨的骨化才刚刚开始。到50日龄时，副蝶骨、围框骨等其它头部骨骼也都完成了骨化。西伯利亚鲟（A.baeri）在20.7mm TL时可被观察到上颌骨、齿骨最先骨化。施氏鲟（A.schrencki）在20日龄（23.20±0.1mm TL）首先被观察到骨化的骨骼，到30日龄（39.75±0.1mm TL），其顶骨、后颞骨、下鳃盖骨、翼耳骨、锁骨、匙骨、颊骨、额骨、围眶骨等头部骨骼都已骨化（见图2）。虽然不同种类的鲟鱼头骨骨化的时间节点有所不同，但骨化的顺序基本一致。最先开始骨化的骨骼均为上颌骨、齿骨和牙齿，这些骨骼的骨化大大增强了鱼苗的摄食能力，随后头部其它部位的部分骨骼逐渐开始骨化。

图1 阿尔新蓝-茜素红染色小体鲟背面观（A）和腹面观（B）粉色为硬骨；蓝色为软骨

鲟鱼的骨板骨化起始时间仅次于颅骨。施氏鲟背骨板24日龄（26.14±0.1mm TL）时开始骨化，30日龄（32.36±0.1mm TL）后骨化程度不再明显增加。侧骨板在30日龄（39.75±0.1mm TL）被观察到骨化。腹骨板在40日龄（76.26±0.1mm TL）基本完成骨化。西伯利亚鲟和波斯鲟骨板骨化时间与施氏鲟相近，背骨板分别在25日龄、20日龄（27mm TL，24.4±2.9mm TL）时被观察到骨化，侧骨板分别在31日龄、30日龄（53mm TL，33.4±3.8mm TL）时被观察到骨化，腹骨板分别在37日龄、50日龄（70mm TL，48.4±6.4mm TL）时被观察到骨化。杂交鲟（H.huso×A.ruthenus）骨板的发育稍晚于上述三种鲟鱼，背骨板在44日龄（44.2mm TL）开始骨化，59日龄（52.7mm TL）完成骨化。侧骨板在59日龄被观察到骨化，91日龄完成骨化。腹骨板在59日龄被观察到骨化，91日龄完成骨化。

鲟鱼的鳍条骨化程度非常高，仅在鳍条边缘仍保留少量软骨。杂交鲟（H.huso×A.ruthenus）背鳍和胸鳍条在59日龄时（52.7mm TL）开始骨化，122日龄（116.3mm TL）时完成骨化。腹鳍和尾鳍条在91日龄时开始骨化，122日龄时完成骨化。施氏鲟在30日龄还没有被观察到鳍条骨化，40日龄（76.26±0.1mm TL）时各鳍鳍条均已发生骨化。

二、鲟鱼骨骼发育分子机制

鲟形目鱼类保留了辐鳍鱼类一些原始的特征，如软骨脊索、异质尾部、盾鳞等，这些特征均和软骨鱼类相同。鲟鱼的主要骨骼均是软骨，仅在脑颅顶部出现一定程度的骨化膜骨。因此，鲟鱼被认为是软骨鱼类至硬骨鱼类进化中的过渡态。

软骨骨化是一个调节严格的过程，涉及软骨细胞成熟，伴有增殖，成熟和肥大的连续阶段，伴有软骨基质合成，钙化和血管生成，然后才是成骨细胞介导的骨化。研究表明软骨鱼象鲨（Callorhinchus milii）的基因组中除了SCPP基因家族（分泌型钙结合蛋白，包括酸性基因dspp、dmp1、ibsp、mepe、spp1及富含Pro/Gln的amel、enam、ambn、amtn和odam）外，与骨骼相关的基因全部存在。研究发现在其它软骨鱼类如小鳐（Leucoraja erinacea）、小斑点猫鲨（Scyliorhinus canicula）以及无颚脊椎动物七鳃鳗（Lampetra japonica）的基因组中也不含任何SCPP基因家族成员，可推测缺乏SCPP基因家族是软骨鱼类骨骼不能骨化为硬骨的主要原因。这一假设在斑马鱼敲除spp1功能基因的实验中得到了验证。Cheng等2020年的研究表明，匙吻鲟（P.spathula）和小体鲟（A.ruthenus）的基因组中存在SCPP基因家族，且与spp1在鲨鱼和斑马鱼中所起的作用不同，推测SCPP家族的其它成员，甚至其它基因家族可能参与了抑制鲟鱼从软骨到硬骨的转变。此外，除了dmp1基因之外，匙吻鲟（P.spathula）和小体鲟（A.ruthenus）保留了大多数酸性SCPP基因，这可能也是鲟鱼具有特殊软骨表型的原因之一。

图2 阿尔新蓝-茜素红染色30日龄施氏鲟骨骼发育

三、鲟鱼软骨的应用开发

本草拾遗记载：鲨鱼翅、鲟鱼骨，食之明目壮阳，延年益寿。可见，鲟鱼软骨既可食用，还具有独特的保健药用功效。

（一）硫酸软骨素的提取和应用

硫酸软骨素（Chondroitin Sulfate,CS）是广泛存在于高等动物软骨组织的酸性糖胺聚糖，具有抗凝、抗炎、抗凝血、抗癌、缓解关节炎、降血脂、防止血管硬化等多种生理功能；且对冠心病、心绞痛、心肌缺氧等心血管疾病的治疗有一定疗效，能显著降低冠心病患者的发病率和死亡率；还对神经元具有保护和修复作用。CS还可活化脂解酶，使脂肪降解，因此是防止肥胖的有效物质。此外，因其具有保水性及高粘性，对肿瘤、病毒活性也具有抑制作用，CS在医药、保健食品及化妆品行业均有广泛应用，开发较多的方式是作为保健品制成软骨素胶囊。

鲟鱼的软骨含量相当高，头、脊索及鳍中软骨含量约占体重的10%，是提取硫酸软骨素易得而又稳定的软骨来源，近年来已在多种鲟鱼中开展了硫酸软骨素的提取。CS的生产工艺很多，常见的提取方法有浓碱提取工艺、稀碱提取工艺、稀碱稀盐提取工艺、稀碱浓盐提取工艺及稀碱-酶解提取工艺等。其中，浓碱提取工艺产品颜色较深，分子量较小，且废碱液对环境的危害较大；稀碱提取工艺蛋白质含量和氮含量较高，生产周期较长；稀碱稀盐和稀碱浓盐提取工艺的产率（14.4%和14.1%）和纯度都较低；稀碱-酶解法生产的产品质量较高，且大大缩短了生产周期，广泛应用于鲟鱼CS的提取。

（二）鲟鱼软骨食品及保健食品的开发

鲟鱼软骨中矿物质、蛋白质、脂肪酸等含量丰富，是很好的食用品。利用鲟鱼软骨制作的软骨羹罐头获得国家发明专利，并已投放市场。北京市鲟鱼、鲑鳟鱼创新团队加工岗位等还开发了鲟鱼软骨丸子。团队加工岗位还利用乳杆菌发酵鲟鱼软骨将其制成骨汁饮料及软骨咀嚼片，二者均具有补钙等保健功能，钙含量高于普通牛奶且为易于吸收的离子钙，可促进人对营养的全面摄入，特别是对钙的补充。

此外，鲟鱼软骨活性成分具有较高的关节修复功效，已被用作关节肿疼、骨质疏松等病人的医用食品及关节功能退化的老年人的日常保健产品。日本有研究还将鲟鱼软骨中的胶原蛋白作为3D打印的原材料，在医学等领域开展应用。