自身免疫类检测试剂的审查思考及建议

付文竹，蔡瑶，徐加发

1 广东省药品监督管理局审评认证中心，广州市，510080

2 江苏省食品药品监督管理局认证审评中心，南京市，210002

3 江苏硕世生物科技股份有限公司，泰州市，225300

0 引言

自身免疫性疾病（autoimmune diseases）是指机体对自身抗原发生免疫反应，从而导致自身组织损害所引起的疾病，总发病率在普通人群中约为3%～5%[1-2]。据统计，近10年来全球自身免疫性疾病的发病率和患病率都处于上升阶段[3]。当人体有异常的免疫反应后，会产生针对自身组织或器官的抗体，其中病理性自身抗体是产生自身免疫性疾病的重要原因之一。因此自身抗体本身成为了大多数自身免疫性疾病的重要血清学标志物，其在疾病诊断、病情监测及预后评估中发挥的作用日益受到重视。然而，对于大多数自身免疫疾病的发病机制尚不清楚，且缺乏统一的标准化检验方法，加上大多数抗体无公认的溯源途径、临床实验室的质量控制和管理水平不高、缺乏规范的结果判读等因素，导致自身抗体类检测试剂在产品注册申报、临床应用过程中存在不规范的现象，因此对于此类产品从注册和审评角度进行梳理分析并给出建议，对于制造商、监管者和临床使用单位具有重要意义。

1 自身免疫性疾病及其抗体概述

自身免疫性疾病指的是自身的淋巴细胞或者抗原表位刺激机体产生的自身抗体，反过来作用于机体，引起疾病的过程[4]。自身抗体主要有两种分类方法，根据自身抗原在体内分布部位可分为器官特异性自身抗体和非器官特异性自身抗体。前者的自身抗原为某一器官的特定成分，病变也局限于该器官，如抗中性粒细胞胞浆抗体、抗RA相关角蛋白抗体。后者的自身抗原为细胞核成分或线粒体或其他细胞结构，病变可出现在全身各种器官，如抗核抗体[5]。根据自身抗体临床意义即敏感性和特异性不同又可分为疾病标志性自身抗体如系统性红斑狼疮中的抗Sm抗体、疾病特异性自身抗体如SLE中抗双链DNA（敏感性70%～80%，特异性90%～95%）、疾病相关性自身抗体如原发性干燥综合征中的抗SSA和SSB抗体（阳性率为70%和40%）、疾病非特异性自身抗体如抗核抗体，可出现在多种自身免疫疾病中[6]。

2 自免试剂盒国内已上市产品情况

截止目前从药监局官网上可以查询已上市的自身免疫性疾病检测试剂盒就超过400个，由于此类产品的临床意义越来越明确，相应的市场需求也在逐年增加，临床常规自身抗体检测项目已达百种以上。在已上市产品中，有些是以某类抗体（谱）来命名产品，有些是以与某种疾病相关的抗体（谱）作为一个注册单元进行申请，不管以哪种形式来命名产品，最终是以产品的预期用途为命名依据。由于自免诊断产品的技术门槛相对较高，国内自免市场上主要仍然以进口产品为主，如欧蒙、胡曼等，随着对自免疾病的认识加深和政策的扶持，国内越来越多企业开始加入进来。

自身抗体的常用检测方法主要为间接免疫荧光法、免疫印迹法、酶联免疫法及化学发光法等基于抗原抗体定性、半定量、定量检测。这其中免疫荧光技术因其具有对自身抗体检测全面，具有能检测未知或难以纯化靶抗原的自身抗体、可发现新抗体等优势，目前是自身抗体检测的金标准[6]，但缺点是检测结果的判断需要实验室经验，有些组织切片的荧光模型（核型）难以分辨，确定滴度的工作量大。因此其他方法学的出现对于传统方法作为一个补充，极大地丰富了临床检测手段，如酶联免疫吸附法可对自身抗体进行定量或定性检测，具有高敏感性，可以用于筛查，也可用于确认，但需对每个自身抗体进行逐项检测，且批内批间差较大，检测线性范围窄，精密度不高，操作过程复杂，易受洗板过程以及酶的稳定性的影响。检测的阳性结果可用滴度或稀释度表示，但有可能检测到没有临床意义的低亲和力抗体[7]。免疫印迹法灵敏度高、特异性强、批间差小，不需要特殊设备，且易操作，一次实验可同时检测多种自身抗体，但膜条上的抗原种类非常有限，其检测结果也多为定性或半定量检测。化学发光免疫分析法具有高敏感性、特异定量及自动化的优点。每种方法有自己的优缺点和局限性，在临床使用上侧重点不同，因此产品在设计开发时的侧重点与关注点也会不同，下面将对申报产品存在的问题及改进建议进行说明。

3 存在问题

自身免疫性疾病发病机理复杂，影响因素多。根据文献报道及实际临床经验，健康人群中也存在一定的自身抗体阳性检出率，检出时间与发病时间不同步等[7-8]。这在一定程度上对验证试剂检测的准确与否带来了判断困难。另一方面，任何试剂都不可避免有一定概率的假阳性，还存在灰区风险，且目前检测试剂盒运用的方法学种类多，产品质量良莠不齐，不同产品检测结果横向比较困难。具体主要体现在以下方面。

3.1 临床诊断的局限性

自身免疫性疾病是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病，随着医学的研究，许多疾病相继被列为自身免疫性疾病，而自身抗体也可以存在于正常人体内，因此自身抗体的存在不能等同于自身免疫性疾病。且很多情况下抗体检测时间早于疾病发病时间，这也使临床诊断更加复杂和困难。目前，针对自身抗体的检测国内采用定性方法较多，如免疫印迹法、酶免法。定性方法的优势主要用在鉴别、初筛，容易出现假阳性，灰区也有主观性。定量产品可以用于对疾病的活跃程度、疾病进程的观察及治疗效果监测具有更好的参考意义，但由于目前自身抗体的检测尚未实现标准化和规范化，不同产品的溯源链不同，检测结果差别大，造成结果无法实现互认。

3.2 试剂盒的质量

自身免疫性疾病检测试剂盒作为目前自身抗体检测的重要技术工具，其本身的质量直接决定了检测结果的准确性，从而可以影响医生对疾病的诊断和处置。试剂盒质量和检测能力受很多因素影响。一是抗原选择；不同厂家的检测试剂采用的抗原不同（如抗原特性、分布、含量等），而不同来源的抗原与自身抗体的结合能力不同，抗原所包含的片段及其构象可能有所不同，针对不同的抗原靶位。二是参考标准：多数自身抗体没有公认的参考物质及参考测量程序，大多无法溯源；缺少合适的商业化质控品，企业采用的质控品多为企业自制；多数自免类产品没有转化血清盘，很多企业自己制定内部参考品评估阳性符合率和阴性符合率。因此定性产品还有一个值得注意的地方是参考样品（比如阳性参考品、阴性参考品）的设置。根据不同的检测项目的实际情况以及产品的预期用途确定参考品。参考样品应该能体现产品在cut-off值的检测能力。三是参考值/区间设置：不同厂家的检测试剂对检测结果的cut-off值设定、参考区间及检测范围的不一致。四是检测指标的兼容性：试剂生产企业从市场利益出发，随意进行多个检测项目组合自身抗体检测，未针对某一疾病特异性抗体谱或相关抗体进行设计，由于包被不同特性的靶抗原在同一反应体系中检测多种自身抗体，彼此结果未有协同作用，反而造成互相干扰，导致了临床诊断效能下降[9]。

4 建议

4.1 灵敏度与特异性

《抗核抗体检测的临床应用专家共识2018》以及临床经验表明，健康人群中的抗核抗体谱也会有一定的阳性检出率，且同一种抗体在不同自身免疫疾病中的阳性检出率不同，如ANA在系统性红斑狼疮中的阳性率为80%～100%，而在类风湿关节炎中的阳性率仅为20%～40%，有些抗体正常人也会有一定程度的阳性检出率，及所谓的假阳性。因此企业在产品设计开发时，应结合临床实际情况和产品预期用途（用于初步筛查或确诊），综合考虑产品的灵敏度和特异性，有针对性地进行开发设计。一般来说，用于筛查的产品对灵敏度要求较高，用于确诊的产品的对特异性要求较高。

4.2 原材料的选择与制备

自免类产品原材料选择是决定产品性能的关键因素，一般涉及的抗原种类较多，无论是企业自制还是外购，都应对抗原的制备与纯化过程进行详细说明，如抗原的序列选择、克隆表达过程及抗原的鉴定、纯化。例如Jo-1蛋白采用的是基因编码的完整的氨基酸序列，与只选择部分氨基酸序列作为抗原相比，前者的免疫原性和抗原表位最完整，最接近天然构象，能够最大程度地识别体内自免抗体。因此蛋白编码序列的选择直接关乎到抗原表位的识别。

4.3 参考品的制备

自身免疫类产品目前不同厂家的检测结果可比性差的最重要原因是没有公认的参考物质及参考测量程序，对于定量产品，溯源途径不同，甚至无法溯源。目前只有少数项目有国际参考物质，比如dsDNA（WHO参考物质，Wo/80）、GAD65（WHO参考物质，97/550）、IA2（WHO参考物质，97/550），对于有国际参考物质的项目应尽可能溯源至国际参考物质，没有国家标准物质或国际参考物质的项目，企业应该建立自己的稳定的溯源链，可选择目前市场上口碑较好的试剂作为溯源。对于定性产品，应建立自己的血清参考盘，设置阳性参考品时应考虑多个滴度，这对于评价不同阳性样本的检出率及符合率很重要，设置阴性样本时也应考虑样本的不同来源，还应包含与申报产品检测项目不同的其他自免疾病类的阴性血清。

4.4 参考值的建立

自身免疫疾病发病相对比较隐匿，所以在很长时间内可以无症状或者症状不典型，进而出现较高的临床漏诊率，但是患病早期已经能够检测到自身抗体的存在，因此，自身抗体筛查就显得非常重要。如果产品的预期用途为筛查患者，那么产品的敏感性高应作为企业研发时首选因素，并对假阳性的情况加以甄别。由于不同的自身抗体在不同疾病中的敏感性及特异性有所不同，同一个疾病相关抗体中，每种抗体的敏感性和特异性不同，或同一个抗体在不同疾病中表现出的敏感性和特异性也会不同。因此，不管是定性产品还是定量产品，试剂生产商应重视参考值的研究，并且充分考虑产品的预期用途。通过查阅国内外相关文献，明确自身抗体在自身免疫性疾病中的流行病学研究进展，自身抗体在性别、年龄、种族、甚至地缘性之间有显著差异[10]。国内厂家往往在开展自免类项目时，直接采用进口产品的参考值进行不充分的验证，可能导致采用的参考区间与临床实际不符，给将来的临床判断带来困难和不确定性。而定性产品更应该根据产品的预期用途（比如诊断目的、目标人群、灵敏度和特异性的要求等），设置合理的cut-off值，应重视cut-off值附近浓度的临床样本的验证，并对灰区的设置进行研究。

4.5 临床评价

近年来，越来越多的新抗体被证实在自身免疫疾病的诊断和检测中有潜在的临床意义，如果申请的抗体不在免临床目录中，应提供临床试验资料，证明产品的临床性能，包括临床决策点。选择比对方法时，应以间接免疫荧光法（IIF）作为比对方法，提交相关临床研究数据，这些研究旨在支持被测物对目标人群适用，以及评估目标人群中的抗体阳性率来验证临床灵敏度。同时建议测试来自其他免疫疾病、感染性疾病以及与性别、年龄相匹配的正常受试者血清样本中的抗体，来验证临床特异性。多数自身免疫性疾病都伴有特征性的自身抗体谱，在进行样本入组时，也应考虑每项检测指标都应符合一定例数。如是定性产品，常用的统计学方法包括阴阳性符合率、卡方检验及Kappa一致性等，如是定量产品，一般进行Bland-Altman分析及偏倚分析，另外医学决定水平处的预期偏倚及其可信区间也是应该关注的内容。