牙髓组织工程支架材料研究进展

张林朴 邹慧儒

天津市口腔功能重建重点实验室，天津市口腔医院暨南开大学附属口腔医院中心实验室 300041

0 引 言

波及牙髓的牙外伤、龋病等牙体硬组织疾病常引起不可逆的牙髓坏死及根尖周病变，导致牙体组织失去营养供给，使牙髓组织丧失应激防御功能，进而导致牙齿遭受更大的破坏。牙髓再生治疗可恢复牙髓活力，促进未发育完成的年轻恒牙牙根继续发育，有助于避免牙齿折裂或其它并发症的发生。全球有超过2/3的人罹患龋病、牙髓病[1]。在牙体牙髓病临床诊疗中，牙髓再生需求广泛。

目前，由于临床上还没有确定有效的全牙髓再生治疗方法，以牙髓细胞、支架材料、生长因子构建活体牙髓的组织工程牙髓再生一直是国内外研究的热点。Xuan等[2]报道了至今世界上病例数最大的使用脱落乳牙牙髓干细胞(stem cells from exfoliated deciduous teeth，SHED)移植获得年轻恒牙牙髓再生和牙根持续发育的临床研究。由于牙本质壁包绕牙髓形成的髓腔及根管系统狭小、多变，且牙髓组织内含神经、血管等结构，组织工程牙髓再生需要综合考虑血运重建、神经再生、生长因子参与和牙髓-牙本质复合体的形成，因而对支架材料选择具有特殊要求。除常规生物相容性、适当的力学特性和生物降解性、连通孔隙度、促细胞黏附、增殖和分化能力，以及诱导因子的结合外，尚需介导牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）与牙本质壁结合再生牙本质，实现牙髓-牙本质复合体再生[3-6]。选择接近牙髓微环境构成的材料，如天然或天然衍生聚合物材料多糖、蛋白质多肽，合成聚合物材料聚酯类多聚体以及功能互补材料结合的复合物，特别是适合牙髓多变形态的可注射水凝胶复合物成为目前研究关注的热点[7]。本文将对牙髓再生研究中组织工程支架材料的应用作简要概述。

1 天然和天然衍生聚合物支架材料

1.1 多糖类支架材料

多糖是以糖苷键链接单糖单位的长链碳水化合物多聚体。天然多糖藻酸盐、壳聚糖、透明质酸支架材料常用于牙髓再生研究。

1.1.1 海藻酸钠

海藻酸钠（sodium alginate,Alg）是一种海藻类来源的多聚糖醛酸盐，水溶液遇二价阳离子，如Ca2+，发生离子交联形成水凝胶。其凝胶的固化条件温和，能减小蛋白质变性，延长其活性周期，具有良好的生物相容性和流变可注射性。分子交联网络结构有利于细胞生长，可形成支持细胞间大分子物质扩散及细胞间信号传导的三维立体微环境。Fujiwara等[8]将兔牙髓细胞与海藻酸钠支架结合移植到裸鼠背部皮下，6周后移植部位可观察到X线阻射钙化结构，并检测到Ⅰ型和Ⅲ型胶原和牙本质涎蛋白表达，发现有成牙本质样细胞和牙本质样硬组织形成，说明海藻酸钠可以作为牙髓-牙本质复合体再生的支架材料。

1.1.2 壳聚糖

壳聚糖（Chitosan）是天然多糖甲壳素脱除部分乙酰基的产物，其结构与细胞外基质中的糖胺聚糖相似。壳聚糖具有良好的生物相容性、生物可降解性、抗菌活性和成骨诱导活性，有利于细胞黏附，同时还可结合生长因子、葡糖氨基聚糖等；但其水溶性差，在pH低于5.5时可溶，当pH大于6或在二价、多价阴离子作用下形成水凝胶。壳聚糖水凝胶强度较低且降解较快。单一组分的壳聚糖携带大量正电荷，对细胞的吸附力过强，不利于细胞增殖，需与聚阴离子材料交联中和部分电荷，以改善材料表面性能。Zheng等[9]研究证实结合碱性成纤维细胞生长因子的三维多孔壳聚糖支架可有效促进人牙髓干细胞黏附和迁移，保持细胞增殖活性，并有利于向神经细胞方向分化，体现了较好的促细胞分化特性。Shrestha等[10]将包被或吸附地塞米松的壳聚糖纳米颗粒贴附于经次氯酸钠处理的牙本质表面，结果显示其有助于保持细胞在牙本质表面的黏附活性，消除消毒剂对细胞活性的影响，有望用于牙髓-牙本质复合体再生研究。

1.1.3 透明质酸

透明质酸（hyaluronic acid，HA）是由N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸为双糖单位重复串联而成的直链酸性黏多糖。透明质酸广泛存在于皮肤、眼睛、关节等组织中，具有滋养和润滑组织、促进细胞附着等作用。有研究显示HA支架具有良好的促进组织再生能力，可直接作用于牙源性干细胞表面受体，激活相关信号通路，促进细胞迁移[11]。Inuyama等[12]在HA海绵中接种成牙本质细胞，结果显示成牙本质细胞可黏附于支架材料，形成稳定结构。Chrepa等[13]发现HA水凝胶包被牙根尖乳头干细胞（stem cells of the apical papilla,SCAP）后可显著促进成牙本质细胞分化和矿化沉积，提示该支架材料具有潜在应用前景。

1.2 蛋白质多肽

1.2.1 胶原蛋白与明胶

胶原蛋白（Collagen,COL）是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，在细胞外基质（extracellular matrix，ECM）中含量最丰富，具有连接和支撑细胞和组织结构的作用。胶原蛋白中I型胶原（COL I）含量最为丰富，约占90%，是组织工程中使用最频繁的支架材料之一。对比其它类型胶原蛋白，COL I可以更好地促进牙髓细胞增殖与矿化[14]。Sumita等[15]制备胶原三维支架材料，结合人牙髓干细胞（human DPSCs，hDPSCs）和釉基质蛋白，观察到有器官化分化的牙髓组织生成，提示该支架材料性能优异。

明胶是一种由动物组织提取的胶原蛋白水解的蛋白质。其化学组成非常接近胶原，具有与胶原相近的生物相容性、可降解性和低抗原性等特点，且价格低廉。明胶通常用作细胞培养的生物衬底和载药工具。组织工程应用需通过结合多肽、矿化颗粒、金属离子等附加修饰以及结构改性达到调节细胞黏附和诱导组织功能分化作用。Qu等[16]使用纳米纤维明胶添加磷酸镁仿生构建接近牙本质基质的纳米结构水凝胶支架材料，可促进牙髓细胞增殖、分化和矿化沉积，体外复合培养和裸鼠体内植入实验均显示成牙本质分化相关标记物有显著表达，且出现矿化物沉积。

1.2.2 纤维蛋白

纤维蛋白是血浆纤维蛋白原经凝血酶激活后聚合形成的产物。对比合成的聚合物和胶原凝胶，纤维蛋白在生物相容性、免疫原性、价格等方面具有很大优势。自体来源的纤维蛋白可从血浆离心直接获取，不引起任何免疫反应且可形成各种形态的三维结构。通过结合聚氨基甲酸乙酯、聚乙烯、透明质酸或磷酸钙陶瓷等，纤维蛋白支架的结构性能已获得显著改善[17]。

1.2.3 丝素蛋白

从蚕丝获得的丝素蛋白是一种能形成纤维的天然蛋白质，被用于医用缝线已近一个世纪。丝素蛋白的蛋白质纤维由丝心蛋白和丝胶蛋白组成。富含甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸等多种氨基酸，具有强度高、弹性好、机械性能稳定和降解率低等特点[18]。丝素蛋白能够通过碳二亚胺偶合成含RGD片段的多肽，通过结合生长和黏附因子增强细胞黏附和增殖能力[19]。Pecci-Lloret等[20]将hDPSCs直接接种在三维多孔丝素蛋白支架上，扫描电镜观察可见24 h内细胞在支架表面黏附伸展，之后逐渐生长至完全覆盖多孔支架表面，提示该支架材料能够支持细胞黏附和增殖。

1.2.4 多肽与自组装多肽

多肽是氨基酸以肽键连接形成的短片段，其组成氨基酸分子中的各基团组装形成特定空间结构，因而具有特殊的生物学活性。多肽水凝胶可模拟细胞外基质，为细胞生长提供理想的生活环境，在组织工程应用中也更具可操作性。多肽分子通过自组装，形成功能性多肽，通过与细胞表面分子序列黏附、作用于酶解位点或与生长因子受体结合诱导细胞响应。Galler等[21]报道自组装含RGD序列的亲水性多肽（GTAGLIGQERGDS），并将氨基端乙酰化，其水溶液与含CaCl2的人牙髓细胞或脱落乳牙牙髓干细胞悬液混合形成多肽水凝胶，可显著促进细胞增殖，并诱导钙化沉积形成。

2 人工合成聚合物材料

合成聚酯类多聚体如聚乳酸（Polylactide,PLA）、聚乙醇酸（Polyglycolic acid,PGA）和聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly lactide-co-glycolide acid,PLGA）、聚左旋乳酸（poly-L-lactic acid，PLLA）、聚乙酸内酯（polycaprolactone，PCL），具有良好的生物相容性、生物降解性且价格低廉；另外，其力学性能、黏稠度、颗粒度或多孔纤维网形态、生物大分子的结合与释放性能等可进行特定设置，对细胞黏附和组织分化诱导具有明确作用[22-24]。Gangolli等[25]分别使用质量浓度为12%和20%的PLGA（75:25）构建整体厚度为（277±15）μm复合双层膜支架材料，孔径分别为（30～45）μm和（5～10）μm，接种hDPSCs后发现细胞可在大孔径膜内黏附伸展至接近支架全层，而小孔径膜组细胞只能黏附在膜表面或仅伸展至支架表层。

截至目前，有多项以PLA或PLGA为支架材料承载牙源性干细胞的动物实验研究证实该策略可获得牙髓组织再生。其中有El-Backly[26]等使用兔源牙髓细胞；Cordeiro等[27]和Sakai等[28]使用人SHEDs；Huang等[29]使用人SCAPs接种到PLA或PLGA多孔纤维网络支架中，然后分别植入到实验兔或裸鼠体内，实验结果均发现可形成与生理性牙髓组织细胞成分和结构非常接近的组织，在髓腔及牙本质表面有类似于管状双层结构的矿化牙本质形成。

3 复合支架材料

细胞外基质（extracellular matrix，ECM）是存在于哺乳动物体内的包绕细胞的复杂实体结构。主要包括结构蛋白（胶原和弹力蛋白）、特殊蛋白（原纤蛋白、纤连蛋白和层黏连蛋白）、葡糖氨基聚糖类（透明质酸）等。ECM不仅可提供结构支撑，还提供细胞代谢环境，细胞通过该介质以完成代谢和信息传递。因此，任何单一组分的组织工程支架材料均无法代替ECM的作用，均需不同组分进行组合，以实现功能互补；或需要活性基团修饰或生长因子参与，才能更好地发挥支架材料作用。在牙髓组织工程应用中，将ECM成分通过亲水性介质或亲水基团与水分子构成水凝胶，更便于多变狭窄形态髓腔内的操作使用[30]。

3.1 多糖类复合材料

HA具有良好的细胞滋养作用。Lee等[17]报道一种由HA酪胺（HA-Tyr）和纤维蛋白组成的互穿网络水凝胶，能显著促进细胞增殖和毛细血管形成。但HA力学性能差、体内降解快，因而需结合性能互补材料进行修饰。Jones等[31]以聚乙二醇二醋酸盐（polye thylene glycol diacrylate，PEGD A）为介质，将HA与胶原交联，构成可注射水凝胶支架，具有良好的临床可操作性，可显著增强hDPSCs细胞的增殖、迁移、分化活性。黄健萍等[32]研究钙黏蛋白多肽修饰的HA水凝胶，将其结合hDPSCs，体外实验发现牙髓细胞可以向神经细胞分化诱导，裸鼠体内实验观察到有钙化沉积形成。曹春玲等[33]使用羟乙基壳聚糖，借助苯甲醛修饰的聚乙二醇（OHC-PEO-CH O）共价交联，形成水凝胶，可显著提高牙髓细胞增殖活性。进一步实验将海藻酸钠和氯化钙溶液混入前二者组分中，可形成羟乙基壳聚糖和海藻酸钠双网络水凝胶，从而显著提高凝胶网络的抗压缩力学性能和成牙本质分化性能。

3.2 蛋白质多肽类复合材料

3.2.1 胶原、明胶基质复合材料

由于胶原是细胞外基质的主要结构蛋白，有胶原蛋白（COL）包被或修饰的特异性功能增强型材料可使其获得更接近细胞外基质的属性，并克服自身机械性能差、易吸收等缺点。Nosrat等[34]使用含有牛COL I和羟基磷灰石颗粒的膏体作为根管内支架材料，用于未成熟前磨牙治疗，结合根尖诱导出血形成根管内血凝块。组织学实验结果证实，COL I支架结合来自于根尖的干细胞，在根管壁表面形成新生牙本质，并出现矿化；而单纯诱导根管内血凝块的根管壁仅有新生纤维结缔组织和不定型矿化物形成。Zou等[35]制备一种经COL I表面修饰的PLGA纤维网络支架，接种hDPSCs，发现其可显著促进细胞增殖与成牙本质细胞分化以及牙本质钙化沉积，形成紧密结合的三维复合体。研究证实COL I表面修饰增强了细胞在PLGA纤维网络支架表面的黏附伸展。Kim等[36]将微孔生物活性玻璃纳米颗粒结合在聚乙酸内酯明胶纳米纤维基质中，发现其能通过整合素、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路促进hDPSCs的成牙本质分化。Nakashima等[37]使用粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF）动员的自体牙髓干细胞，将其加入含有G-CSF的去端肽胶原溶液中，植入根管预备后的根管内，胶原海绵封闭髓腔后，玻璃离子水门汀垫底，复合树脂充填。通过5例临床探索性研究确定再生的牙髓组织具有活力，并观察到功能性牙本质形成。

3.2.2 丝素蛋白复合材料

丝素蛋白的特性有利于体外制备形成三维纤维网络结构，在此基础上，添加特异性诱导分化材料或生长因子，可促进细胞完成功能分化。Zhang等[38]在六氟二丙醇基（hexafluoro-2-propanol,HFIP）丝素蛋白和水合丝素蛋白多孔支架上接种新生4 d大鼠牙囊细胞，发现这些丝素支架不仅可诱导骨性牙本质形成，还对骨性牙本质形态与大小具有调控作用。接种hDPSCs也观察到钙化结节的形成以及牙髓组织形成。此后，该课题组制备丝素蛋白/羟基磷灰石支架结合hDPSCs放置在牙根管中植入裸鼠皮下，通过在该支架材料中混合超顺磁性氧化铁微粒，MRI成像观察发现支架材料性能稳定，细胞毒性小，组织再生与材料降解相适应。免疫组化分析显示有成牙本质分化相关蛋白阳性表达，HE和茜素红染色显示根管内有再血管化和矿化组织形成[39]。Yang等[40]在结合有碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）的丝素蛋白多孔支架中接种hDPSCs，放置在牙根段的髓腔中，然后异位植入裸鼠体内，4周后取出，结果发现结合bFGF的支架材料hDPSCs复合体形成具有良好脉管结构的牙髓样组织，并且有新基质沉积和牙本质样组织形成。说明添加特殊生长因子的丝素蛋白支架材料能够支持hDPSCs的功能性分化。上述研究均提示丝素蛋白作为一种性能优良的支架材料，在牙髓再生应用研究中将发挥重要作用。

3.2.3 多肽类复合材料

多肽容易合成，且比较稳定，多种氨基酸片段有宽泛的组装剪切选择，可以形成纳米纤维结构，因此越来越多地应用于牙髓再生研究中。Chan等[41]将hDPSCs包裹于自组装多肽纳米纤维水凝胶中，细胞凝胶复合体经体外矿化诱导培养后，植入裸鼠皮下，4周后取出。可见钙化组织和毛细血管形成，且检测到多种成骨标记物阳性表达，X线阻射影达到78%。体现了自组装多肽纳米纤维支架支持hDPSCs特异性分化的作用。Galler等[42]以具有细胞黏附性的自组装多肽纳米纤维水凝胶包裹hDPSCs，添加成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor,FGF）、转移生长因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）以及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）。结合细胞和生长因子的水凝胶复合物放置在牙根段髓腔内，植入裸鼠皮下，形成血管化类牙髓组织。Xia等[43]制备含RGD片段和模拟VEGF肽段表位的自组装多肽水凝胶，接种DPSCs和脐静脉内皮细胞，观察到该支架材料可以促进细胞增殖、诱导微血管形成，有望用于牙髓-牙本质复合体再生。

工程化设计的功能基团及可注射水凝胶系统使多肽支架具有商品化应用优势。Dissanayaka等[44]使用PuraMatrix多肽水凝胶，评价其在体内形成血管化牙髓再生的潜力。他们将人脐静脉内皮细胞和hDPSCs包裹在PuraMatrix多肽水凝胶中，在没有外源性生长因子作用下，多肽纳米纤维微环境支持细胞增殖、迁移和毛细血管网形成。将单纯hDPSCs或复合细胞水凝胶植入实验大鼠体内，均观察到有钙化牙本质斑块的牙髓样组织形成。复合细胞水凝胶组显示有更多细胞外基质、血管和钙化组织形成。此外，一种商业化应用的多肽链——Dentonin，其含有整联蛋白结合域（RGD）和磷酸糖蛋白糖胺聚糖结合域（SGDG），而细胞外基质磷酸糖蛋白（m atrix extracellular phosphoglycoprotein，MEP E）是激活DPSCs增殖和成牙本质分化的关键起始活性基团。因此Nguyen等[45]利用Dentonin结合一种水溶性自组装多肽根链，改性形成可注射纳米纤维多肽水凝胶，混合细胞后体外培养。结果显示，对比单纯多肽根链组和以类似Dentonin肽链替代修饰组，功能性多肽水凝胶对混合的成纤维细胞或DPSCs具有显著促进增殖作用，并能形成正常牙本质钙化沉积。

3.3 生物基质提取物复合材料

生物基质提取物是从动物或人体血浆或特定组织中提取的含部分细胞或无细胞成分，含有组织基质多种组成成分和特定组织细胞功能分化信息，可直接作为支架材料用于组织工程。

3.3.1 富血小板浓缩物

富血小板血浆（platelet-rich plasma,PRP）是一种来源于血浆成分通过特定离心方式得到的含高浓度血小板的血浆提取物，自20世纪90年代中期开始用于口腔医学领域，可显著促进创口愈合。通过改进离心方法，目前已发展形成第2代血浆制品的富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin,PRF）和第3代的浓缩生长因子（concentrated growth factor,CGF）。PRP、PRF、CGF作为血浆提取物研究的3个阶段的产物，在血小板浓缩量、白细胞含量、纤维蛋白凝块形成和结构特征等方面有明显不同，因而有着不同的临床应用价值。

PRP、PRF、CGF和其相关的组成成分（生长因子和纤维蛋白）可显著促进牙源性干细胞增殖、迁移与功能分化，对牙本质再生和血管新生具有明显促进作用[46-48]。有研究显示PRF的作用优于PRP，并能在炎症微环境中保持对DPSCs的促增殖、迁移与分化作用[47]。研究还显示DPSCs可紧密结合在富含血小板和白细胞的密集纤维蛋白网络的CGF支架表面，细胞突触伸展到CGF的微孔中，细胞之间借伪足突触形成紧密连接，形成良好三维空间结构[48]。因而血小板浓缩物具有支架以及释放生长因子的双重作用，可用于牙髓再生研究。

由于来源于自身的血浆成分获取方便，无免疫原性，含有天然生长因子和纤维蛋白网架结构，已有研究将其作为无细胞支架，结合刺激根尖周出血直接应用于临床牙髓再生治疗。由于研究背景的差异，有个别研究认为结合使用PRP、PRF、CGF和目前临床单纯使用刺激根尖周出血引流到根管内的血凝块充盈法治疗效果无显著差异[49]，但是多数研究报告认为结合PRP、PRF或CGF的治疗方法可趋化诱导根尖组织来源干细胞，获得根管壁增厚、牙根延长、根尖孔缩窄的效果，而且根尖孔闭合程度、牙根增长长度、牙髓感觉功能恢复程度和根管壁新生牙本质沉积量等中、远期效果尤其显著，优于目前临床常规采用的血凝块充盈法[50-52]。其内在机制尚有待进一步研究。

3.3.2 牙本质基质提取物

Athirasala等[53]研究认为包绕牙髓腔的牙本质基质中含有大量促牙髓生成信号分子。其中有机基质可以分为两种主要组分：①不溶于酸性条件并在组织中占比最高的有机成分I型胶原。②小分子非胶原蛋白，如附加糖胺聚糖（Glycosarninoglycans,GAGs）的蛋白聚糖（Proteoglycans,PGs）和生长因子。而牙本质基质蛋白保有对细胞存活、增殖和分化有重要作用的正常细胞黏附位点（RGD）和基质金属蛋白酶（matrix metalloprotein,MMP）结合位点。利用海藻酸钠具有的强成胶能力，将二者以不同比例组合，制备海藻酸钠-牙本质基质（Al g-Dent）复合溶液；然后接种人SCAPs或hDPSCs，构成3D打印母液，打印时以CaCl2共价交联形成凝胶。结果显示适当比例的Alg-Dent在体外复合细胞，能持续保持细胞活性。这无疑是一种保持高度牙髓细胞增殖与分化活力和更具可操作性的支架材料的选择。

4 结 语

综上所述，组织工程牙髓再生支架材料相关体外实验研究已在细胞增殖、分化以及与支架结合机制方面取得较大进展，体内动物实验已获得接近正常牙髓组织各组分和成牙本质细胞贴附根管壁、具有牙本质小管形态的新生牙本质沉积等牙髓-牙本质复合体再生证据，同时也有为数不多的获得成功的牙髓再生临床研究报告。然而，牙髓-牙本质复合体结构复杂，组织工程再生策略临床应用还受到相当多的条件限制，有待进一步深入探讨。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突