紫杉醇联合他莫昔芬对人乳腺癌细胞MCF-7的作用

姜晓晔，姜婷婷，李冉，王璇，孙世猷，程序

(1.武汉城市学院 医学部，武汉 430083；2.武汉市第四医院 心血管内二科，武汉 430000；3.燕山大学 校医院，秦皇岛 066000)

乳腺癌是最常见的女性恶性肿瘤之一，发病率约占各类恶性肿瘤的7%，抗雌激素药物他莫昔芬是预防乳腺癌复发和扩散的一线药物[1]。然而，患者对他莫昔芬的耐药限制了其使用，大约50%长期使用他莫昔芬的乳腺癌患者产生继发性耐药[2-4]。联合用药可减少他莫昔芬药量，降低继发性耐药率，同时增加乳腺癌细胞对药物的敏感性[5-6]。研究证实，他莫昔芬与抗肿瘤成分白藜芦醇联合使用可明显抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖并增加肿瘤细胞对他莫昔芬的敏感性[7]。

紫杉醇也是重要的天然抗肿瘤成分之一，通过抑制微管蛋白解聚将肿瘤细胞的细胞周期阻滞于G2/M期，最终导致其凋亡[8]。紫杉醇联合他莫昔芬对MCF-7细胞的作用及其机制还有待进一步探究。该研究探索这2种药物是否具有抗MCF-7细胞的协同效应，以期为两者联合应用提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂人乳腺癌细胞MCF-7，购自上海谷研实业有限公司；RPMI 1640 培养液、FCS和胰蛋白酶，购自Gibco公司；MTT试剂，购自Biosharp公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)，购自上海碧云天生物技术有限公司；Anne-xin Ⅴ-FITC/PI流式凋亡试剂盒，购自BD公司；兔抗人β-actin多克隆抗体、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)多克隆抗体、Bcl-2多克隆抗体、Bax多克隆抗体和山羊抗兔IgG二抗，购自CST公司；0.22 μm PVDF膜，购自Biosharp公司；青霉素-链霉素溶液、Hoechst 33258染色液、DMSO、双染蛋白marker和显影液，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；紫杉醇注射液，购自扬子江药业集团有限公司；他莫昔芬片剂，购自阿斯利康投资(中国)有限公司；CCL22、IL-10、TGF-β1 ELISA检测试剂盒，购自北京百奥莱博科技有限公司。

1.2 主要仪器化学发光成像仪、Western blotting电泳仪、垂直电泳槽和转移电泳槽(Bio-Rad公司)；全自动酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)；FACScan流式细胞仪(BD公司)；倒置荧光显微镜IX73[奥林巴斯(中国)有限公司]；CT14RD高速冷冻离心机(上海天美科学仪器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 细胞的培养 将人乳腺癌细胞MCF-7置于含10% FCS、1%青霉素-链霉素的RPMI1640培养液中，于37 ℃、5% CO2培养箱中常规培养。

1.3.2 紫杉醇、他莫昔芬单药对肿瘤细胞增殖的影响 用0.25%胰蛋白酶消化对数生长期MCF-7细胞，以2 000 个/孔密度接种于96孔板，细胞贴壁后分别加入单药，总体积200 μL/孔。紫杉醇组按浓度梯度分为2、5、10、25和50 ng/mL处理组，他莫昔芬组则分为6.25、12.5、25、50和100 μg/mL处理组，对照组加入等量的培养液。每个处理浓度设3个复孔，24 h后进行MTT检测。

每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，孵育4 h后弃上清液，加入150 μL DMSO振荡15 min，检测光密度D(490 nm)值并计算细胞增殖抑制率。用GraphPad Prism 6软件计算2组MCF-7细胞24 h的半数抑制浓度(inhibitory concentration 50， IC50)。对于后续的细胞凋亡实验、Western blotting及ELISA检测均以他莫昔芬和紫杉醇IC50为用药浓度。

增殖抑制率=[1-(D给药后-D给药前)/(D对照组-D对照本底)]×100%

1.3.3 紫杉醇与他莫昔芬联合用药对肿瘤细胞增殖的影响 用0.25%胰蛋白酶消化对数生长期MCF-7细胞，以2 000 个/孔密度接种于96孔板，细胞贴壁后加入药物，使总体积为200 μL/孔。加入紫杉醇与他莫昔芬共同作用24 h，联合用药药物浓度的选择见参考文献[9]，终浓度为紫杉醇IC50×1/8+他莫昔芬IC50×1/8，紫杉醇IC50×1/4+他莫昔芬IC50×1/4，紫杉醇IC50×1/2+他莫昔芬IC50×1/2，紫杉醇IC50×1+他莫昔芬IC50×1，紫杉醇IC50×2+他莫昔芬IC50×2。通过Chou-Talalay中效方程式为基础设计的软件CompuSyn完成统计分析。联合指数(combination index，CI)>1提示药物间为拮抗作用，CI=1示药物间为相加作用，CI<1示药物间为协同作用。

1.3.4 荧光显微镜下观察肿瘤细胞凋亡情况 MCF-7细胞完全贴壁后分别加入3组药物(紫杉醇、他莫昔芬和紫杉醇联合他莫昔芬),对照组加入等量的培养液。作用24 h后，收集各组约106个细胞，用预冷PBS漂洗2次。4%甲醛4 ℃固定细胞10 min后涂片，晾干。用5 mg/L Hoechst 33258染色液作用5～10 min，滤纸吸净多余液体。荧光显微镜下观察染色细胞并摄片。

1.3.5 FACS检测肿瘤细胞凋亡和细胞周期分布 收集各组细胞5×104个/组，分别按细胞凋亡(PI、Annexin Ⅴ-FITC双染)和细胞周期(PI单染)试剂盒说明书操作，FACS检测细胞凋亡和细胞周期分布情况。

1.3.6 ELISA检测肿瘤细胞细胞因子的分泌 3组药物作用细胞24 h后，取各组上清液按照ELISA说明书检测CCL22、IL-10、TGF-β1表达，根据标准曲线读取各组浓度。

1.3.7 Western blotting检测肿瘤细胞凋亡相关蛋白的表达 超声振荡10～15 s裂解各组细胞，分别提取总蛋白。各取20 μL上清液，95～100 ℃热处理5 min；置冰上冷却后离心5 min，SDS-PAGE，转膜；5%脱脂牛奶封闭，加入一抗(抗β-actin、PCNA、Bcl-2、Bax，1∶1 000稀释)4 ℃过夜孵育，再加入山羊抗兔IgG二抗(1∶10 000稀释)室温孵育1 h；ECL曝光成像，化学发光成像仪分析结果。

2 结果

2.1 紫杉醇及他莫昔芬单药和联合用药对MCF-7细胞的增殖抑制作用MCF-7细胞在紫杉醇组、他莫昔芬组用药24 h后的IC50分别为11.38 ng/mL和30.87 μg/mL。单用两药对MCF-7细胞增殖的抑制作用随着药物浓度的增加而增强，具有浓度依赖性(图1)。相较于单药组，两药联合作用对肿瘤细胞增殖的抑制增加显著(均P<0.05，图2)。CompuSyn软件分析显示两药联合时，CI=0.79，呈协同作用。Western blotting检测结果显示，紫杉醇+他莫昔芬组相较于单药组PCNA表达水平明显降低(图3)。

注：与紫杉醇和他莫昔芬联合组相比，*P<0.05。图2 各用药组对MCF-7细胞的体外抑制作用

图3 紫杉醇与他莫昔芬联合用药对MCF-7细胞PCNA表达的影响

2.2 荧光显微镜下观察肿瘤细胞凋亡情况3组药物作用于MCF-7细胞24 h后，与对照组比较，各给药组凋亡细胞数增多，且紫杉醇+他莫昔芬组较紫杉醇组、他莫昔芬组凋亡细胞数增多(图4)。

2.3 紫杉醇及他莫昔芬单药和联合用药对MCF-7细胞凋亡和细胞周期的影响紫杉醇及他莫昔芬按IC50作用于MCF-7细胞24 h后，经Annexin Ⅴ-FITC/PI流式凋亡试剂盒染色观察到各组细胞凋亡率不同，对照组、紫杉醇组、他莫昔芬组及紫杉醇+他莫昔芬组凋亡率分别为(5.56±0.12)%、(15.51±2.34)%、(18.82±3.21)%和(25.24±2.28)%。紫杉醇+他莫昔芬组较单药组细胞凋亡明显增多(图5)。细胞周期分析显示，紫杉醇阻滞(50.18±1.56)%细胞于G0/G1期，他莫昔芬阻滞(49.26±2.17)%细胞于G0/G1期，而紫杉醇+他莫昔芬组阻滞(75.29±2.48)%细胞于G0/G1期，提示联合用药产生协同作用阻滞细胞周期于G0/G1期，抑制细胞增殖(图6)。

注：白色箭头表示凋亡细胞。图4 紫杉醇及他莫昔芬单药和联合用药对MCF-7细胞凋亡的影响(×200)

图5 紫杉醇和他莫昔芬单药及联合用药对MCF-7细胞凋亡的影响

注：A. 各处理组MCF-7细胞细胞周期百分比； B. 各处理组MCF-7细胞细胞周期百分比定量结果。图6 紫杉醇及他莫昔芬单药和联合用药对MCF-7细胞细胞周期的影响

2.4 紫杉醇及他莫昔芬单药和联合用药对MCF-7细胞Bcl-2、Bax表达的影响Western blotting检测结果显示，与对照组相比，他莫昔芬组、紫杉醇组和紫杉醇+他莫昔芬组细胞培养上清液中Bcl-2蛋白表达水平明显下降，Bax表达水平明显升高，其中联合用药组相较于单药组变化更明显(图7)。

2.5 紫杉醇及他莫昔芬单药和联合用药对MCF-7细胞CCL22、IL-10、TGF-β1表达的影响ELISA检测结果显示，与对照组相比，他莫昔芬组、紫杉醇组和紫杉醇+他莫昔芬组细胞培养上清液中CCL22、IL-10、TGF-β1表达量均显著下降，联合用药组显著低于单药组(均P<0.05，表1)。

图7 紫杉醇及他莫昔芬单药和联合用药对MCF-7细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

表1 紫杉醇及他莫昔芬单药和联合用药对MCF-7细胞CCL22、IL-10、TGF-β1表达的影响

3 讨论

我国乳腺癌发病率居女性肿瘤首位，其转移与复发也是导致乳腺癌患者死亡的主要原因。服用他莫昔芬可使有乳腺癌家族史的女性罹患风险降低30%以上，并且也可有效降低患者的复发死亡风险[10]。因此，他莫昔芬已成为临床上预防和治疗乳腺癌的首选药物。然而，约50%长期使用他莫昔芬的乳腺癌患者产生继发性耐药。他莫昔芬的主要作用机制为与雌激素竞争性结合ER，阻断雌激素作用于乳腺癌细胞的信号通路，抑制ER阳性乳腺癌细胞增殖。而紫杉醇对多种肿瘤存在抑制作用，现已广泛应用于临床，成为肿瘤化疗药物的首选。

MTT检测结果表明，他莫昔芬与紫杉醇单药处理MCF-7细胞都可抑制其增殖，其PCNA蛋白表达量明显减少。紫杉醇和他莫昔芬作用24 h后的IC50分别为11.38 ng/mL和30.87 μg/mL，两药联合作用时CI<1，呈协同作用。可能的原因为：紫杉醇促进微管蛋白聚合形成微管，同时抑制已形成的微管解聚，从而抑制细胞分裂增殖，不仅限于抑制ER阳性乳腺癌细胞[8]；联合用药可打破他莫昔芬只抑制ER阳性乳腺癌细胞增殖的局限，增加其疗效。

研究结果表明，他莫昔芬与紫杉醇单药都可诱导MCF-7细胞凋亡，可能机制是降低了乳腺癌细胞中凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达，上调了促凋亡蛋白Bax的表达，从而下调了Bcl-2/Bax比值，促使肿瘤细胞凋亡[11]。这与金伟[12]和高菲菲[13]的研究结果一致。他莫昔芬与紫杉醇联合用药时MCF-7细胞凋亡率可达(25.24±2.28)%，且与单药比较Bax表达明显上升、Bcl-2表达明显下降。这表明他莫昔芬与紫杉醇发挥协同抗肿瘤作用的重要机制是诱导细胞凋亡。

近年来，人们越来越认识到肿瘤细胞的免疫逃逸在疾病发生、发展过程中发挥重要作用[14-15]。已有研究表明，肿瘤细胞通过分泌免疫调节因子IL-10和TGF-β1影响机体的免疫应答水平，促进肿瘤细胞免疫逃逸[16-18]。尽管肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤微环境中IL-10的主要来源，但乳腺癌MCF-7细胞也可产生IL-10降低机体抗肿瘤免疫应答水平，促进肿瘤免疫逃逸[19]。Li等[20]研究表明，乳腺癌组织中肿瘤源性CCL22和TGF-β1的相互作用可诱导Treg积聚，并参与Treg的组织浸润及趋化；Treg可能主要通过肿瘤微环境中细胞因子的表达和受体与细胞因子的相互作用间接影响肿瘤细胞，进而影响乳腺癌的进展。研究结果表明，与单药组相比，紫杉醇与他莫昔芬联合用药下调了免疫调节因子IL-10、TGF-β1和CCL22的分泌。这提示紫杉醇与他莫昔芬联合用药可逆转MCF-7细胞引起的免疫抑制作用，增强机体抗肿瘤杀伤效果。该结论已得到Kassa等[21]的研究结果支持，他们证明紫杉醇通过下调TGF-β1的分泌发挥免疫佐剂作用。

综上所述，紫杉醇联合他莫昔芬可能通过下调免疫调节因子IL-10、TGF-β1和趋化因子CCL22的表达发挥协同抗肿瘤作用。