体外应用HDAC抑制剂TSA诱导骨髓细胞分化为MDSC的实验研究

赵曙光，高伟年，于丁，陈子英

(河北医科大学第二医院 心外科，石家庄 050000)

髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cell, MDSC； CD11b+Gr-1+Ly6C+F4/80intCD115+)是不完全分化的未成熟骨髓(bone marrow，BM)细胞和骨髓祖细胞(myeloid progenitor cell，MPC)的罕见异质群体[1]。它们在炎症环境下可从MPC扩增而来[2]，具有抑制T细胞增殖的能力[3]。许多因素可调控MDSC分化，诸因素导致的髓系祖细胞(common myeloid progenitor cell，CMPC) 发育分化异常会生成MDSC[4]。目前文献可考的诱导MDSC生成的方案多基于GM-CSF、G-CSF、IL-1β、IL-6、LPS等因子的不同组合，IL-6等炎性因子发挥了重要作用[5]。体外研究发现，直接抑制T细胞组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)从而增加组蛋白H3赖氨酸乙酰化，可上调转录因子Foxp3转录，使T细胞产生免疫抑制活性[6]，因此，HDAC是重要的细胞表观遗传辅助调节因子，并经典地调节基因表达。已经证明，单独应用HDAC抑制剂可抑制DC分化[7-8]并降低这些抗原提呈细胞的刺激能力[9]，减少这些细胞的MHC基因产物、共刺激分子和促炎细胞因子的表达[10]。鉴于HDAC抑制剂具有调控细胞转录因子及炎性基因表达的能力，本研究假设广谱HDAC抑制剂曲古抑菌素A(trichostatin A，TSA)能够阻止未成熟BM细胞分化为成熟BM细胞，同时应用大剂量GM-CSF使造血细胞向髓样偏移[11]，从而进一步体外收获BM细胞来源的MDSC。虽然MDSC是肿瘤生长的“帮凶”[12]，但鉴于其具有抑制移植物抗宿主病(graft versus-host disease，GVHD)和介导实验性移植耐受的能力[13]，已成为继Treg后又一个被公认的抑制移植排斥的细胞治疗剂[14]。本研究将进一步考察体外获取的MDSC对异基因效应T细胞的抑制效应。

1 材料与方法

1.1 材料8～12周龄的无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级C57BL/6 及BALB/c雄性小鼠，体质量18～22 g，由北京维通利华实验动物公司提供，饲养于河北医科大学动物中心层流房，动物饲料及辅料经60Co辐射处理，饮用水为洁净级。重组小鼠GM-CSF(recombinant mouse GM-CSF，rmGM-CSF)、抗CD11b-FITC、抗Gr-1-别藻蓝蛋白(allophycocyanin，APC)及同型对照抗体购自BD公司，TSA购自Sigma公司，小鼠Treg分选试剂盒、鸡尾酒抗体-FITC、抗CD25-藻红蛋白(phycoerythrin，PE)、MS及LS分选柱、抗荧光磁珠购自Miltenyi Biotec公司，RPMI 1640培养基、FCS、Ficoll购自Gibco公司，小鼠IL-6 ELISA检测试剂盒购自晶美公司，MTT购自Sigma公司。FACScalibur E2943型FCM购自BD公司，Multiskom MK3型酶标仪购自雷勃公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠BM细胞及脾脏单个核细胞的制备 采用颈部脱臼法处死C57BL/6小鼠，用乙醇浸泡消毒，摘取小鼠股骨及胫骨，用无菌纱布擦刮附着在骨头上的残余肌肉，用生理盐水将骨髓腔中的BM冲洗至40 μm滤网上，研磨后获得BM细胞悬液，将细胞悬液置培养箱12 h，取悬浮BM细胞以备培养。摘取小鼠脾脏，剪碎后于40 μm滤网上研磨，获得脾脏单个核细胞悬液。

1.2.2 TSA与rmGM-CSF联合对BM细胞的体外诱导 应用抗CD11b-FITC、抗Gr-1-APC标记BM细胞，使用FCM检测抗原表达情况。将BM细胞分为3组，分别采用TSA、rmGM-CSF、TSA+rmGM-CSF培养， 在第2、4和6天向培养物中加入rmGM-CSF(1 000 U / mL)及TSA(1 nmol/L)，第7天收获细胞并再次用FCM检测CD11b、Gr-1抗原表达情况。

1.2.3 各组BM细胞培养液中IL-6水平的ELISA检测 培养BM细胞第7天，将细胞培养液离心并取上清液，设空白孔，依据试剂盒要求依次加入样品，封板，37 ℃温育30 min，弃去液体，甩干，加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次。每孔加入酶标试剂 50 μL(空白孔除外)，温育后再次洗涤，每孔先加入显色剂A 50 μL，再加入显色剂B 50 μL，振荡混匀，37 ℃避光显色15 min。每孔加终止液50 μL终止反应。以空白孔调零，依次测量各孔的光密度[D(450 nm)]值。

1.2.4 小鼠Gr-1+MDSC、CD4+CD25-T细胞及CD4+CD25+Treg的磁珠分选 应用鸡尾酒抗体-PE 4 ℃避光标记PBMC 10 min(10 μL含107个细胞)，经缓冲液洗涤2次后加入抗PE磁珠，LS柱阴选细胞为CD4+T细胞。将抗CD25-FITC加入CD4+T细胞标记10 min(10 μL含107个细胞)，缓冲液洗涤2次，加入抗FITC磁珠，经MS柱分选获取CD4+CD25-T细胞和CD4+CD25+T细胞。应用PE-Gr-1mAb标记体外培养后的BM细胞10 min(10 μL含107个细胞)，经缓冲液洗涤2次后加入抗PE磁珠，LS柱阳选细胞为Gr1+细胞。用以上方法分别获取C57BL/6小鼠Gr-1+MDSC、CD4+CD25+Treg及BALB/c小鼠CD4+CD25-T细胞以备进一步检测。

1.2.5 混合淋巴细胞培养 用RPMI 1640普通培养液调整各组细胞数为1×106个/mL，分别设定C57BL/6小鼠Gr-1+MDSC、CD4+CD25+Treg为抑制细胞S1和S2，BALB/c小鼠CD4+CD25-T细胞为应答细胞R。设置CD4+CD25-T细胞对照组及S1+R(1∶1)、S2+R(1∶1)混合组。各组均加入经丝裂霉素灭活的C57BL/6小鼠脾细胞(2×105个/mL)。各组混合细胞放置于37 ℃ CO2培养箱中孵育68 h，观察细胞的增殖能力。离心后置于含MTT溶液(10 μL/孔)的培养液中4 h，加入盐酸-异丙醇，用酶标仪检测D(570 nm)值。

2 结果

2.1 各组诱导培养BM细胞分化及MDSC相关抗原的表达天然BM细胞作为MDSC生成的前体细胞群，在缺乏外界细胞因子刺激的情况下，细胞群MDSC相关标志物Gr-1、CD11-b表达较弱。单独应用TSA对BM细胞进行诱导后发现，TSA并不能促进BM细胞的分裂增殖，且对BM细胞的分化具有抑制作用，而单独应用rmGM-CSF可诱导BM细胞向单核粒系细胞偏移，且3 d后细胞增殖明显加快，第5天细胞分化明显，出现普遍贴壁现象。在TSA联合应用rmGM-CSF的情况下，BM细胞增殖快于单独应用TSA。在培养第7天，检测各组细胞的MDSC相关标志物发现，TSA组出现CD11b+Gr-1+细胞，但细胞分散且收获数量较少；rmGM-CSF组CD11b+Gr-1+细胞含量低；TSA+rmGM-CSF组可诱导出CD11b+Gr-1+细胞群，双阳性细胞约占59.7%，因此认为，所收获的细胞为富含MDSC的细胞群。(图1、图2)

注：A.天然BM细胞；B.单独应用TSA诱导培养BM细胞7 d；C.单独应用rmGM-CSF诱导培养BM细胞7 d；D.TSA+rmGM-CSF诱导培养BM细胞7 d。图1 各组BM细胞CD11b、Gr-1的FACS检测

注：A.天然BM细胞；B.单独应用TSA诱导培养BM细胞7 d；C.单独应用rmGM-CSF诱导培养BM细胞7 d；D.TSA+rmGM-CSF诱导培养BM细胞7 d。图2 各组BM细胞的分化发育(10×40)

2.2 BM细胞培养液IL-6水平的检测培养BM细胞第7天，将各组细胞培养液离心并取上清液，使用ELISA检测IL-6水平。结果显示，单独应用rmGM-CSF刺激分化的BM细胞IL-6分泌水平较少[(96±8)pg/mL]，应用TSA刺激分化的BM细胞IL-6分泌水平增加[(232±11)pg/mL]，而TSA+rmGM-CSF刺激分化的BM细胞，其培养液中含有较高水平的IL-6[(514±47)pg/mL]，rmGM-CSF组及TSA+rmGM-CSF组培养液中IL-6水平较单独应用TSA组差异均有统计学意义(均P<0.05)。(图3)

注：与TSA组比较，*P<0.05。图3 ELISA检测各组细胞第7天培养液中IL-6水平

2.3 磁珠分选Gr-1+BM细胞、CD4+CD25-T细胞及CD4+CD25+Treg应用TSA联合rmGM-CSF培养的天然BM细胞分化为具有Gr-1及CD11b高表达的细胞群体，应用抗Gr-1-FITC标记细胞群，采用磁珠阳选进一步提高MDSC纯度，获得阳性率为93.8%的CD11b+Gr-1+细胞(图4A)，将该细胞群视为纯度较高的MDSC，同样采用磁珠分选获取CD4+CD25-T细胞(图4B)及CD4+CD25+Treg(图4C)，将以上3组细胞用于混合淋巴细胞培养。

2.4 混合淋巴细胞培养在混合淋巴细胞培养实验中，对照组CD4+CD25-T细胞在培养68 h后呈现较强的增殖能力，而当MDSC、CD4+CD25+Treg分别与CD4+CD25-T细胞混合培养(S1+R、S2+R)后CD4+CD25-T细胞的增殖能力均被有效抑制。研究证实，经磁珠分选获得的MDSC具有较强的抑制T细胞增殖的能力，然而该MDSC对异基因效应T细胞的免疫抑制能力弱于Treg。(图5)

注：与S1+R组比较， *P<0.05。图5 MTT法检测各组混合淋巴细胞培养中CD4+CD25-T细胞的增殖情况

3 讨论

到目前为止，特异性调控MDSC分化的因素尚未被发现[5]，现有的诸多体外诱导制备方案均为细胞因子及生长因子的组合，诱导分化效率低下，无法满足细胞治疗的应用[15]。本研究采用外源性HDAC抑制剂参与诱导MDSC形成，其高效的细胞诱导及扩增体系的建立将推进MDSC的基础与应用研究。

本研究从小鼠BM中获取天然BM细胞，在体外直接采用HDAC抑制剂(TSA)培养BM细胞，以影响CMPC的正常分化发育，同时联合大剂量的rmGM-CSF诱导BM细胞向髓系细胞偏移，来获取更多的MDSC。细胞培养结果显示，BM细胞在rmGM-CSF方案下3～5 d均有明显增殖，而在TSA组，细胞分化成熟受到抑制，细胞增殖不明显。在BM细胞培养的第7天，rmGM-CSF组细胞明显贴壁，而TSA组贴壁不明显。因此，认为TSA主要抑制了BM细胞的正常分化发育，而rmGM-CSF则促进了BM细胞向单核粒系细胞的分化和增殖，当用TSA+rmGM-CSF刺激培养BM细胞时，最终收获的应以单核系MDSC为主。

有文献报道，鼠MDSC共表达CD11b和Gr-1，分别占正常鼠BM细胞和脾细胞群体的20%～30%和2%～4%[16]。本研究发现，小鼠天然BM细胞低表达CD11b和Gr-1，认为小鼠BM在非炎性及非肿瘤环境中不是形成MDSC的“土壤”。在应用TSA及TSA+rmGM-CSF方案诱导BM细胞7 d后发现，培养细胞Gr-1、CD11b表达明显增强，虽然TSA作用于BM细胞的详细机制尚未阐明，但可初步推断组蛋白乙酰化主要发生在H3、H4的N端比较保守的赖氨酸位置上，H3、H4的乙酰化可打开一个开放的染色质结构，增加特定基因的表达[7]，推测HDAC抑制剂作为细胞表观遗传辅助调节因子，可能调控了BM细胞与分化相关的转录因子的水平，进而影响了相关基因的表达，从而阻断了BM细胞分化为成熟的BM细胞。本研究也证实，TSA可以诱导BM细胞炎性因子IL-6的分泌。进一步用磁珠分选的Gr-1+细胞纯化MDSC，经混合淋巴细胞培养实验证实，Gr-1+细胞可以有效抑制CD4+CD25-T细胞的活化增殖，应用TSA 联合rmGM-CSF方案可以诱导BM细胞向MDSC分化。

综上所述，TSA联合大剂量rmGM-CSF可以在体外诱导BM细胞高表达Gr-1、CD11b，诱导出的MDSC呈现较强的免疫抑制活性，具有较高的细胞治疗应用价值。目前已知，C/EBP、PU.1及STAT家族转录因子可以非特异性地调控MDSC生成[17]，HDAC是重要的表观遗传辅助调节因子，组蛋白乙酰化提供了精确的调控机制，但只有其中一小部分基因受HDAC调控抑制[18]。胞内组蛋白乙酰化调控如何影响免疫抑制类细胞的分化尚需进一步阐明。