杠柳苷元诱导鼻咽癌细胞凋亡及其作用机制的研究

李世坚，焦爱军

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是耳鼻咽喉科常见恶性肿瘤，其发病因素包括遗传因素、环境因素及EB病毒感染等[1-2]。鼻咽癌起病隐匿，多数患者确诊时已为晚期，采用放化疗也仅80%左右的患者病情得到控制，而靶向治疗因费用高昂，在临床上应用具有局限性[3-4]。因此，临床上在不断寻找可以更好地控制鼻咽癌、解决临床难题的药物。近年来中草药单体在抗肿瘤活性方面的研究有很大进展[5]。本研究筛选抗鼻咽癌的实验中得到香加皮中的杠柳苷元单体有较强的抗鼻咽癌低分化CNE2细胞的活性，而目前关于杠柳苷元抗鼻咽癌的报道较少。本研究试图明确杠柳苷元抗鼻咽癌细胞的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 杠柳苷元标准品，质量分数≥98.0%，分子式：C23H34O5，生产批号：BP1613，购于成都普瑞法科技开发有限公司。目的基因扩增引物由华大基因科技有限公司合成。

1.2 细胞及细胞培养 低分化NPC细胞系CNE2细胞，购自湘雅医学院细胞库。细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，置于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养，以0.25%胰蛋白酶消化细胞并传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.3 主要仪器 CellTiter-Glo化学发光细胞活性检测试剂盒购自美国普洛麦格公司，荧光定量PCR仪(型号7500)购自美国应用生物系统(ABI)公司，低速离心机(型号WTL-4K)购自湘仪集团，涡旋震荡器(型号MZX-28+)购自杭州米欧仪器公司，数显恒温水浴箱(型号HH-W420)购自江苏金怡仪器公司，移液器购自美国赛默飞世尔公司。

1.4 CellTiter-Glo发光法检测杠柳苷元对鼻咽癌细胞的生长抑制 取对数生长期的鼻咽癌CNE2细胞，以每孔100 μl密度接种于96孔板中，待细胞贴壁后弃上清。各组分别加入100 μl含杠柳苷元0.5 μmol/L、1.5 μmol/L、3 μmol/L、5 μmol/L、7 μmol/L的RPMI-1640培养液，每组设置3个平行孔。继续培养48 h。实验结束前，每孔分别加入100 μl提前24 h 4 ℃解冻的CellTiter-Glo液体，于振荡仪上震荡10 min，然后用酶标仪在Luminescent模式下检测每孔的吸光度(A)，并用空白对照组调零，根据各孔的吸光度(A)计算IC50(半抑制浓度)值。抑制率(IR%)=(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100%。

1.5 qRT-PCR检测检测鼻咽癌细胞凋亡基因 取对照组以及1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L杠柳苷元处理48 h的CNE2细胞，用TRIzol试剂提取细胞总RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，所用引物的序列和检测程序见表1、2。

表1 引物序列

表2 检测程序

1.6 Western blot检测CNE2细胞凋亡相关蛋白酶 取对数生长期CNE2细胞，调整细胞密度后接种于96孔培养板中。实验组各孔加入1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L的杠柳苷元，继续培养48 h，按照caspase-3蛋白酶活性检测试剂盒说明书的要求进行操作，将蛋白标准品(0.5 mg/ml)加入待测孔内，酶标仪检测562 nm处的OD值。依照校准曲线和样品体积计算蛋白质样品的浓度。

2 结 果

2.1 杠柳苷元对人鼻咽癌细胞增殖的影响 在一定浓度范围内，随杠柳苷元浓度升高，对CNE2细胞增殖的抑制作用增加。见图1。通过曲线得杠柳苷元作用于CNE2细胞在48 h的IC50为1.712 μmol/L。

图1 杠柳苷元对人鼻咽癌细胞增殖的影响

2.2 CNE2细胞的凋亡相关基因的表达水平 与对照组相比，杠柳苷元浓度为1 μmol/L的caspase-3 mRNA表达量少量上升作用不明显、2 μmol/L的caspase-3 mRNA表达量上升，有一定的作用(P<0.05)。而浓度为4 μmol/L的caspase-3 mRNA表达量显著上调(P<0.01)。与对照组相比，不同浓度下杠柳苷元的EGFR mRNA的表达量影响结果无统计学意义。见图2。

2.3 CNE2细胞的凋亡相关蛋白酶的表达 各个细胞组的内参GAPDH的表达量基本一致，说明了2种细胞的的各组的上样质量一致，目的蛋白的表达量变化是情况的有意义的。杠柳苷元处理CNE2细胞48 h后，与对照组相比较，杠柳苷元组的caspase-3蛋白酶的表达水平皆显著上调，差异有统计学意义(P<0.01)；EGFR蛋白酶表达量与对照组相差不大，差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

3 讨 论

杠柳苷元具有抗炎、强心、利尿及抗肿瘤等作用，其药物开发潜力较大[6-8]。既往在抗肿瘤细胞相关的早期筛选实验中已发现杠柳苷元即使在纯度很低的情况下也能对抗多种肿瘤细胞，即有显著的细胞毒性，并且杠柳苷元相关溶血实验显示未见溶血反应，由此推测杠柳苷元具有研发的潜在价值[8]。本研究使用不同浓度杠柳苷元处理低分化鼻咽癌细胞株CNE2，结果显示，杠柳苷元对CNE2细胞增殖的抑制作用呈现一定浓度依赖关系，表明杠柳苷元能够抑制鼻咽癌细胞的增殖。本研究中杠柳苷元作用于CNE2细胞在48 h的IC50为1.712 μmol/L，充分显示出杠柳苷元可通过作用于CNE2发挥抗鼻咽癌的显著作用。与韩宇博等[11]研究中杠柳苷元对不同来源的肿瘤细胞的IC50范围(0.46～1.50 μg/ml)相差不大。

注：C.对照组；1.1 μmol/L；2.2 μmol/L；4.4 μmol/L；与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

注：与对照组比较，**P<0.01

目前对于治疗恶性肿瘤的共识为抑制肿瘤细胞的增殖及促进肿瘤细胞的凋亡。细胞的正常凋亡可维持生物的组织、器官的完整性及平衡性。当生物体内细胞凋亡相关途径发生紊乱，突变的细胞通过细胞凋亡的途径却不能消除，从而导致该突变细胞不断积累，最终癌化，形成肿瘤[12-14]。本研究通过设置不同浓度的杠柳苷元作用于CNE2细胞，结果显示，与对照组相比，1 μmol/L、2 μmol/L杠柳苷元浓度处理的鼻咽癌细胞中caspas-3 mRNA表达量均下调，差异明显，而浓度为4 μmol/L的杠柳苷元组caspas-3 mRNA表达量显著上调，差异显著。这提示不同浓度杠柳苷元对鼻咽癌CNE2细胞中caspas-3 mRNA表达的影响不同，而4 μmol/L的杠柳苷元更有利于通过上调caspas-3 mRNA，从而达到诱导鼻咽癌细胞凋亡的目的。受实验局限性影响，本实验并未检测更多不同浓度杠柳苷元处理下鼻咽癌细胞中caspas-3 mRNA的表达，因此关于杠柳苷元上调caspas-3 mRNA的最适宜的浓度还有待更多实验研究。而不同浓度杠柳苷元处理下鼻咽癌CNE2细胞中EGFR的表达相差不大，提示杠柳苷元可能对EGFR的影响不大，也可能与杠柳苷元的浓度不足以影响CNE2细胞有关，有待更多研究验证。本研究采用Western blot对caspas-3及EGFR蛋白酶进行检测，结果发现caspase-3蛋白酶表达水平皆较对照组上调，而杠柳苷元对EGFR蛋白酶表达水平影响不大。这也进一步验证了杠柳苷元可通过对caspase-3的调控而诱导鼻咽癌细胞凋亡。

综上所述，杠柳苷元可明显抑制鼻咽癌细胞的增殖，其机制可能为通过上调凋亡基因caspase-3及其蛋白酶的表达而诱导细胞凋亡。