响应面优化法利用枣汁发酵生成甘油的工艺

尹蓉，殷龙龙，张倩茹，王贤萍，梁志宏

1. 山西农业大学果树研究所，果树种质创制与利用山西省重点实验室（太原 030031）；2. 山西农业大学功能食品研究院（太原 030031）

甘油（丙三醇，CHOHCHOHCHOH）是众多民生领域如食品、洗护化妆、医药保健、纺织等行业的必备原料，但我国甘油生产缺口大，一大部分依赖于进口[1]。近年来合成甘油大幅度发展，而皂化甘油由于肥皂产业的萎缩导致产量大幅度下降，虽然二者和甘油性质相似，但只限于某些行业可以替代[1-2]。在此种条件下，发酵甘油因其广泛的应用范围引起了关注[2-3]。发酵甘油的原材料来源广泛且价格低廉，可以是淀粉类或糖类物质，也可以是某些含淀粉、含糖的副产物，而且生产难度较低、有害物生成少，适合于一些中小企业生产，可缓解我国甘油供应紧张的问题[2,4-5]。

甘油是酿酒酵母（Saccharamyces cerevisiae）酒精发酵中仅次于乙醇、CO2的副产物，甘油的产量可因酵母对亚硫酸的适应而显著提高[6-8]。研究表明，碱性条件下在5%的糖溶液中，加入亚硫酸钠，用葡萄酒酵母进行连续发酵，可得到转化率为51%产量的甘油（以发酵糖计量），用紫外线照射的啤酒酵母突变株较未照射的菌甘油产量可提高20%～25%[2]。酵母菌种、发酵液pH、含氮物、SO2加量、通风、发酵温度等因素均可对甘油的形成产生影响。康毅等[9]研究表明，在初始葡萄糖质量浓度216 g/L、果糖质量浓度144 g/L、发酵温度32 ℃、pH 3.0、SO2添加量40 mg/L的条件下，经酿酒酵母D254发酵，获得的甘油最高产量达655.64 μmol/L。王秀菊等[10]研究得出发酵温度、铵盐的添加及SO2剂量均对苹果酒、梨酒甘油产量有一定的影响，但同种条件下梨汁发酵产生的甘油要高于苹果汁。Chen等[11]研究磷酸氢二铵（DAP）的添加对荔枝酒发酵的影响，结果发现添加0.5 mmol/L的DAP在荔枝酒在发酵早期显著提高了其甘油和酒精的含量，且甘油产量的增长量高于酒精。

红枣是山西多个地区的支柱产业。近些年，种种原因导致一些本地品种尤其是产量最大的木枣存在严重滞销浪费现象，再加上当地气候造成的大量残次枣、落枣、劣枣[12-14]，如何利用过剩红枣资源成为一个重要课题。红枣含有很高的糖分[15-16]，而干枣储备可不受季节供应的影响，因此可将过剩红枣作为原料进行发酵甘油的生产。试验以干红枣热提汁作为甘油发酵的原料，利用传统甘油发酵的原理，在枣汁中添加亚硫酸钠（Na2SO3），在碱性条件下发酵，研究发酵条件的影响，并结合响应面分析法，摸索到成效最佳的实验室工艺条件，为初步利用红枣汁生产甘油奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

木枣，购于山西省吕梁市临县，要求枣果无病虫害、无腐烂；国光高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司，市售。乙腈（色谱纯）、亚硫酸钠、氢氧化钠、盐酸、甘油（分析纯）、屈臣氏纯净水。

1.2 仪器及试剂

WATERS e2695凝胶液相色谱仪（2141RI检测器、Empower 3色谱工作站、SMH G18SMH018G色谱恒温箱、SUPELCOGEL Ag2树脂型糖分析柱）；0.45 μm水系溶剂针筒过滤器（天津市科亿隆实验设备有限公司）；超声波清洗仪（中国昆山市超声仪器公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 试验流程

干红枣→清洗→切割（将每颗枣切割三刀）→加热提汁（加入5倍体积纯净水，加热至70 ℃后停止，常温静置提汁12 h）→过滤（孔径0.048 mm筛网）→调糖度（浓缩或加入水，根据试验需要）→将枣汁pH调制7以上→菌种活化及接种（以0.4 g/L的浓度称取活性干酵母，加入适量浓度为2%的葡萄糖溶液，置于37℃水浴锅中连续搅拌15min，而后加入枣汁中，并混合均匀[17-18]）→发酵→取样测定

1.3.2 色谱条件

流速1 mL/min，压力上限4 000 PSI，输送体积50μL，总流量1 mL，加速到10 mL/min所需的时间2 min，目标柱温30 ℃，柱温范围±5 ℃，甘油标准曲线时柱温保留10 min，枣酒样品保留40 min。

1.3.3 甘油标准曲线的绘制

用分析纯甘油、乙腈分别配制5，10，15，20，25和30 g/L的甘油溶液，在上述条件下，甘油大约在5.51 min出峰，以甘油质量浓度为横坐标，相对应的峰面积为纵坐标，绘制甘油标准曲线，结果见图1。

1.3.4 样品前处理及测定

枣汁发酵完成后，取枣发酵液，用0.45 μm水系溶剂针筒过滤器过滤，之后以1∶3比例与乙腈混合，充分混匀，静置4 h 后，取上清液再次用0.45 μm水系溶剂针筒过滤器过滤[17,19-20]，加入液相进样瓶，进样量为20 μL。

1.3.5 数据处理

采用Excel、Designer-Expert 10.0.7软件进行数据处理及分析。

图1 甘油溶液的标准曲线

2 结果与分析

2.1 单一发酵参数试验

2.1.1 pH对枣汁甘油生成量的影响

调整枣汁糖度至20 °Brix，取350 mL置于三角瓶中，加入2%亚硫酸钠（Na2SO3），以NaOH和盐酸调pH，分别将pH调至7.2，7.5，7.8，8.1和8.4，每个处理重复3次，接入活化好的国光酵母，于30 ℃发酵至残糖低于4 g/L，测定枣发酵液中甘油质量浓度。pH对枣汁发酵甘油生成量的影响如图2所示。发酵中初始pH对枣汁甘油生成量影响很大，一开始随着pH的升高，甘油产量逐渐提高，pH在7.4～8.1时，甘油产量维持在高水平；pH＞8.1时，甘油产量大幅度下降。说明pH升高到一定的水平会明显抑制甘油生成。因此，生产中宜将pH控制于7.4～8.1之间。

图2 pH对枣汁发酵甘油生成量的影响

2.1.2 发酵温度对枣汁甘油生成量的影响

取350 mL 20 °Brix枣汁置于三角瓶中，加入2%亚硫酸钠（Na2SO3），以NaOH和盐酸调pH至7.8，分别在28，30，32，34和36 ℃下恒温发酵，每个处理重复3次，接入活化好的国光酵母，发酵至残糖低于4 g/L，测定枣发酵液中甘油质量浓度。发酵温度对枣汁发酵甘油生成量的影响如图3所示。枣汁发酵适宜温度在28～36 ℃之间，不同的温度对甘油最终生成量影响很小，但总体呈现先上升后下降的趋势，甘油产量最高的发酵温度为32 ℃。

图3 发酵温度对枣汁发酵甘油生成量的影响

2.1.3 枣汁初始糖度对枣汁甘油生成量的影响

通过浓缩或稀释，分别将枣汁调至5，10，15，20和25 °Brix，取350 mL置于三角瓶中，加入2%亚硫酸钠（Na2SO3），以NaOH和盐酸调pH至7.8，分别在30 ℃下恒温发酵，每个处理重复3次，接入活化好的国光酵母，发酵至残糖低于4 g/L，测定枣发酵液中甘油质量浓度。枣汁初始糖度对枣汁发酵甘油生成量的影响如图4所示。枣汁初始糖度对甘油生成量影响较大，初始糖度＜20 °Brix时，初始糖度增加会使甘油最终生成量相应增加，但高于20 °Brix时，甘油生成量开始下降，说明高糖度导致渗透压增加，影响了酵母的活性。因此20 °Brix是枣汁发酵甘油最适合的初始糖度。

2.1.4 Na2SO3添加量对枣汁甘油生成量的影响

取350 mL 20 °Brix枣汁置于三角瓶中，分别加入1%，2%，3%，4%和5%浓度的亚硫酸钠（Na2SO3），以NaOH和盐酸调pH至7.8，分别在30 ℃下恒温发酵，每个处理重复3次，接入活化好的国光酵母，发酵至残糖低于4 g/L，测定枣发酵液中甘油质量浓度。发酵温度对枣汁发酵甘油生成量的影响如图5所示。Na2SO3添加量对枣汁发酵甘油的生成具有一定的影响，当Na2SO3添加量为3%时，甘油生成量最大；高于3%时，甘油生成量开始下降。可能是因为高浓度的Na2SO3会影响枣汁发酵液pH和渗透压，从而抑制了发酵动力。因此，3%的Na2SO3添加量最适合枣汁发酵甘油。

图4 枣汁初始糖度对枣汁发酵甘油生成量的影响

图5 Na2SO3添加量对枣汁发酵甘油生成量的影响

2.2 发酵参数响应面优化试验

2.2.1 响应面优化试验设计与结果

由单因素试验结果可知，在较适宜的温度范围内，发酵温度对试验结果影响小，因此选择pH（A）、枣汁初始糖度（B）和Na2SO3添加量（C）为考察因子，利用Design-Expert 10.0.7设计三因素三水平试验，研究其在枣汁发酵甘油中的互作影响。试验设计及结果见表1。

表1 响应曲面法试验设计表及结果

2.2.2 模型方程的建立与显著性分析

通过Design-Expert 10.0.7对表1结果进行回归分析，得到甘油质量浓度（H）的回归方程：H=46.02-0.41A+1.94B+0.98C-0.78AB+2.69AC+1.12BC-2.86A2-6.87B2-2.41C2。

对二次回归方程进行方差分析，显著性分析如表2所示。模型p＜0.01，说明该模型各因素关系极显著；失拟项p＞0.05，表现为不显著，说模型回归方程能够反映枣汁发酵甘油的生成与各因素的关系；3个因素对甘油生成浓度的影响分别是：pH（A）极显著，枣汁初始糖度（B）和Na2SO3添加量（C）不显著；AB、AC、BC中，A和C、B和C对响应值的交互影响均为显著；因素A2、B2、C2对响应值的曲面效果全部极显著；模型的相关系数R2=0.965 3，说明有96.61%试验数据可变性可用此模型来解释，说明该回归方程的拟合度良好，模型预测值与试验值关联度高，该方程可适用。

表2 各试验因素的方差分析

2.3 响应面优化分析

图6 各因素交互作用对枣汁甘油生成的等高线及响应曲面图

通过Design-Expert 10.0.7软件处理，得到枣汁甘油生成的等高线及响应曲面图，见图6。由图6（a）可知：等高线呈椭圆形，响应曲面坡度较陡峭，且pH一侧的坡度更为陡峭，说明二者的交互作用显著，且pH对枣汁甘油生成的影响要高于枣汁初始糖度；由图6（b）可知：等高线呈椭圆形，响应曲面坡度较陡峭，且pH一侧的坡度更为陡峭，说明二者的交互作用显著，且pH影响要高于Na2SO3添加量；由图6（c）可知：等高线呈椭圆形，响应曲面坡度陡峭，且Na2SO3添加量一侧的坡度相对更为陡峭，说明二者的交互作用显著，而Na2SO3添加量的影响要高于枣汁初始糖度。

2.4 响应面最佳参数验证试验

通过Design-Expert 10.0.7设计得到枣汁发酵甘油最佳优化参数：pH 7.67、枣汁初始糖度19.58 °Brix、Na2SO3添加量2.81%，预测甘油生成量为46.62 g/L。考虑可操作性，将参数数值保留1位小数，在pH 7.7、枣汁初始糖度19.6 °Brix、Na2SO3添加量2.8%、温度32 ℃的条件下进行验证试验，重复试验设置3次，3次甘油生成实测值的平均数为46.29 g/L，与预测值偏差小，说明该模型能较好预测枣汁发酵生成甘油的试验，具有较高的利用价值。

3 结论

在单因素试验的基础上，运用Box-Behnken响应面法对枣汁发酵甘油的工艺进行优化分析。结果表明，pH、枣汁初始糖度和Na2SO3添加量在枣汁发酵甘油中起着重要的作用，其中pH的作用尤为显著，各参数之间交互作用明显。枣汁发酵甘油的最优工艺参数为pH 7.7、枣汁初始糖度19.6 °Brix、Na2SO3添加量2.8%。在此参数下，甘油生成量可达46.29 g/L。在最优工艺参数下，响应面法预测理论值与实际值接近，说明该模型具有实用价值。此次试验为枣汁发酵甘油提供一定的理论基础，在丰富甘油传统生产法发酵法途径中，具备一定的实用意义和环保价值；还可为解决山西红枣过剩、浪费的现象提供可行性参考。