响应面分析法优化美国黑莓花青素提取工艺

吴哲，刘冠群，张娇，冯夏珍，叶松华，阮文辉

1. 山西省药品检查中心（太原 030031）；2. 山西省医药与生命科学研究院（太原 030016）

美国黑莓（Rubus subgenusRubus Watson）是蔷薇科悬钩子属植物，原产于美洲，1986年引入我国，在江苏、安徽、湖南、湖北、山东、重庆、四川等地区大范围引种栽培，产生可观的农业经济价值[1]。与树莓比较，美国黑莓有更强的抗逆性和抵抗虫害能力，适应能力强，易于种植推广。作为世界粮农组织推荐的第三代水果，黑莓含有维生素C、17种人体必需氨基酸、丰富的花青素，营养价值丰富[2]。

花青素又称为花色素，随着酸碱度改变其颜色在红色、蓝色和无色之间转变。花青素是具有C6—C3—C6碳骨架结构类黄酮化合物，自然状态下通过糖苷键与糖类连接形成花色苷并不以单体状态存在[3]。花青素有多方面生物功能，可将体内的超氧自由基还原并清除，具有抗氧化作用[4]；花青素经过酰基化的修饰后，可有效地抑制杂环化合物（如吲哚、咪唑、喹啉类物质）引起的突变作用[5]；通过激活其抗氧化防御体系可预防老年退化性疾病并有延缓衰老的作用功效[6]；通过抑制脂肪酸和三酰甘油合成相关酶的mRNA水平，改善肥胖和高血糖[7]。

美国黑莓的研究集中在引种栽培方面，对果实中花青素涉及较少。提取果实的花青素常以酸化醇作为提取剂，提取时间、温度、料液比、pH等均会对提取率有交叉影响[8-10]。试验旨在以响应面法对美国黑莓花青素提取进行工艺优化，得到操作性强、高效明确的提取方法，为其深层次开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器和设备

超声波清洗器（QC1026，深圳市臻洁康科技实业有限公司）；紫外可见分光光度计（AUW220D，Thermo Fisher Scientific-CN）；真空泵（SHZ-IIID，上海知信仪器技术有限公司）；电子天平（BSN-220.3，上海卓精电子科技有限公司）；精密pH计（PB-10，赛多利斯科技仪器有限公司）；电热恒温水浴锅（HH-6，北京市长风仪器仪表公司）。

1.2 材料和试剂

美国黑莓果实（采自江苏南京于-20 ℃冷冻保藏）。

盐酸、氢氧化钾（北京试剂化工厂）；无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司）；氯化钾、无水乙酸钠、柠檬酸（天津市风船化学试剂有限公司）；冰乙酸（天津市恒兴化学试剂制造有限公司）；试剂均为分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 花青素的提取

配制缓冲液：0.2 mol/L氯化钾和0.2 mol/L盐酸，二者体积比50∶134，用冰醋酸调至pH 1.0；使用1 mol/L醋酸钠，以醋酸调至pH 4.5。

用匀浆机将美国黑莓粉碎呈浆状，用电子分析天平称取2.00 g样品于100 mL棕色具塞三角瓶中，加入酸性乙醇（盐酸含量3.65%，pH 3），摇匀，于功率240 W超声清洗机中超声浸提一段时间。将其提取液抽滤，得到滤液。取2份1 mL滤液，分别用pH 1.0、pH 4.5缓冲溶液按1∶25定容待测。

1.3.2 花青素含量的测定

采用pH示差法[11]进行含量测定。pH变化会影响花青素结构，在pH 1时波长512 nm处有最大吸收峰，在pH 4.5时花青素转化为无色的甲醇假碱。分别在512和700 nm处测定提取液的吸光度大小，计算如式（1）所示。

式中：C为提取液中花青素的含量，mg/g；M为标准物质矢车菊素-3-葡萄糖苷的相对分子质量，449.2；A0为A512nm-A700nm，pH 1.0；A1为A512nm-A700nm，pH 4.5；V为提取液总体积，mL；n为提取液稀释倍数；m为样品质量，g；ε为Cy-3-Glu消光系数，26 900。

1.3.3 花青素提取的单因素试验

按1.3.1方法，固定其余条件不变，研究不同提取时间、温度、液料比、乙醇体积分数等因素对美国黑莓花青素提取效果的影响。

1.3.3.1 提取时间对花青素含量的影响

在液料比20∶1（mL/g）、提取温度35 ℃、乙醇体积分数75%条件下，考察不同提取时间（20，30，40，50和60 min）对花青素提取效果的影响。

1.3.3.2 提取温度对花青素含量的影响

在液料比20∶1（mL/g）、提取时间30 min、乙醇体积分数75%条件下，考察不同提取温度（25，35，45，55和65 ℃）对花青素提取效果的影响。

1.3.3.3 酸性乙醇体积分数对花青素含量的影响

在液料比20∶1（mL/g）、提取时间35 min、提取温度30 ℃条件下，考察不同乙醇体积分数（30%，45%，60%，75%和90%）对花青素提取效果的影响。

1.3.3.4 液料比对花青素含量的影响

在提取时间35 min、提取温度30 ℃、乙醇体积分数75%条件下，考察不同液料比（5∶1，10∶1，15∶1，20∶1和25∶1 mL/g）对花青素提取效果的影响。

1.3.4 响应面优化试验设计

以单因素试验结果为依据，考虑实际生产效率，选取体积分数、液料比和提取温度为自变量，以花青素含量为响应值，根据Box-Behnken试验设计，优化乙醇超声提取美国黑莓花青素的最佳工艺参数。试验的因素与水平设计见表1。

表1 响应面设计的因素和水平

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取时间对花青素含量的影响

如图1所示，在25～35 min之间，花青素含量随着时间增加而提高。35 min之后含量逐渐下降，说明花青素含量经过35 min超声提取达到最高，溶液基本饱和。花青素本身并不稳定，极易被空气氧化。提取时间继续增长，其含量反而下降。考虑到实际生产应用，最佳提取时间选择35 min。

图1 提取时间对花青素含量的影响

2.1.2 提取温度对花青素含量的影响

如图2所示，在20～30 ℃之间，花青素含量随着温度升高而提高，在30 ℃时花青素含量达到最高。30～60 ℃之间曲线呈下降趋势，花青素含量逐渐降低。相关研究表明，随着温度升高，花青素3-糖苷结构会加快水解，而此结构对维持花青素稳定性至关重要[12]。经过匀浆，花青素并不稳定，果酱与提取液接触面积较大，而花青素在较高温度下极易分解。提取温度过低会导致溶解度低不利于花青素溶解。

图2 提取温度对花青素含量的影响

2.1.3 乙醇体积分数对花青素含量的影响

如图3所示，乙醇体积分数在30%～60%内，花青素含量逐渐上升。乙醇体积分数为75%时，花青素含量最大。乙醇体积分数大于75%时，花青素含量缓慢下降。提取液随着乙醇体积分数上升，其亲水性逐渐下降，而亲脂性增强，极性逐渐减弱。根据相似相溶的原理，花青素极性大，易溶于极性较强的溶液[13]，在乙醇体积分数较低情况下，黑莓中糖类亲水性强，更容易溶解。乙醇体积分数达到75%时，花青素极性与溶液极性接近，溶解性最佳。体积分数上升更高，提取液极性下降，花青素溶解能力下降，且黑莓中极性稍低的物质在乙醇溶解能力上升，导致花青素含量略有下降。

图3 乙醇体积分数对花青素含量的影响

2.1.4 液料比对花青素含量的影响

如图4所示，液料比在5∶1～20∶1（mL/g）内，花青素含量较快上升。液料比达到20∶1（mL/g）时，花青素含量最高。液料比大于20∶1（mL/g）后，花青素含量略有减小。随着液料比提高，黑莓果浆与溶剂能够充分接触，利于花青素溶解[14]。液料比大于20∶1（mL/g）后，花青素含量下降，可能由于花青素主要存在于美国黑莓植物细胞液泡和细胞质之中，使用超声提取能够破坏植物的细胞壁和细胞膜，利于花青素的溶出。在液料比较大情况下，单位体积内的美国黑莓匀浆浓度下降。由于超声提取功率没有改变，对果浆的作用力减弱因而减缓单位时间内花青素溶出。

图4 液料比对花青素含量的影响

2.2 响应面试验的结果与分析

2.2.1 响应面优化美国黑莓花青素提取条件试验结果

在单因素试验基础上，根据Box-Behnken中心组合试验原理，进行试验设计。共有17个试验点，其中12个析因试点，5个中心试点。试验结果见表2，回归方程的方差分析结果见表3。

表2 响应面试验设计以及结果

使用Design-Expert 8.0.6对表2数据进行多元回归拟合，可以得到美国黑莓花青素含量对乙醇体积分数、液料比、提取温度之间关系的二次多项式回归方程：Y=2.54+0.071X1+0.22X2+0.11X3+0.2X1X2-0.035X1X3+0.075X2X3-0.1X12-0.33X22-0.094X32。

表3 回归方程方差分析结果

表3中，乙醇体积分数、液料比、提取温度的一次项和二次项，以及乙醇体积分数与液料比交互项均达到极为显著水平（p＜0.01）；液料比与提取温度交互项达到显著水平（p＜0.05）。对一次项系数绝对值F进行比较可知，3种因素对花青素含量影响排序为液料比＞提取温度＞乙醇体积分数。

2.2.2 花青素含量响应曲面分析

用Design-Expert 8.0.6建立X1、X2、X3对响应值Y构成的响应面图及由其投影形成等高线图。如图5（A）所示，在温度30 ℃条件下，考察乙醇体积分数与料液比的交互作用；如图5（B）所示，在液料比20∶1（mL/g）条件下，考察乙醇体积分数与提取温度的交互作用；如图5（C）所示，在乙醇体积分数70%条件下，考察液料比与提取温度的交互作用。

图5 各因素交互作用影响的曲面图和等高线图

等高线可直观反映两两因素对花青素含量交互作用，等高线如果呈圆形表示二者交互作用不显著，如果是椭圆形或马蹄形表示交互作用显著[15]。在一定响应值范围内，等高线越密集，表示交互作用越不显著，反之，稀疏表示交互作用越显著[16-17]。曲面图中坡度越陡峭，表明响应值受条件因素的影响越大；反之曲面坡度越趋于平缓，其响应值受条件因素改变的影响也就越小[18]。

图5中（A）与（C）等高线呈椭圆形，与（B）相比等高线较稀疏、中心点颜色深。说明乙醇体积分数和液料比、提取温度、液料比交互作用显著。图5中（B）等高线近似于圆形，故乙醇体积分数和提取温度交互作用不显著。比较3个曲面图可知，液料比对花青素含量影响最大，其曲线坡度最为陡峭，与方差分析的结果一致。

以花青素含量最高为目标，使用Design-Expert 8.0.6进行分析，所得最优工艺参数为乙醇体积分数88.42%、液料比23.42∶1（mL/g）、提取温度36.90℃，此条件下花青素含量为2.68 mg/g。据实际生产将工艺条件修正为乙醇体积分数88%、液料比23∶1（mL/g）、提取温度37 ℃，在此条件下做3次平行试验，花青素平均含量2.61 mg/g与模型预测基本相符。

3 结论与展望

在提取时间、提取温度、乙醇体积分数、液料比的单因素试验基础上，通过Box-Behnken设计及响应面试验，得出美国黑莓提取花青素最佳工艺条件：乙醇体积分数88%、液料比23∶1（mL/g）、提取温度37 ℃。此时花青素含量为2.61 mg/g，与预测值（2.68 mg/g）接近，该模型能较好预测花青素的含量。

因人工合成色素对人体具有危害，食品工业中天然色素的开发越来越受到重视。花青素是一类非常有实用价值天然色素。曾有研究将花青素4号位上用甲基或酚基代替，以解决花青素不稳定的应用瓶颈[19]。花青素中如花生衣色素、桑葚红色素、红球甘蓝色素等已经在食品工业中广泛应用，且由于其具有抗菌作用，还起到一定防腐剂功能[20]。美国黑莓引入中国多年，对其花青素应用研究鲜有报道。试验通过优化美国黑莓花青素提取条件，为其进一步纯化后在食品、保健食品领域的应用提供参考依据。