婴配乳粉基氯酸盐和高氯酸盐标准样品的研制与评估

李清清，宋瑞，杨轶眉

上海市质量监督检验技术研究院，国家食品质量监督检验中心（上海）（上海 200233）

乳粉实物标准样品是带有乳粉基质的质控样品，可作为开展检测方法确认与质量控制的良好工具。根据在全国标准信息公共服务平台[1]和国家标准物质资源共享平台[2]查询，我国目前有乳制品实物标准物质/样品28种，主要为乳制品中营养物质和菌落标准样品，但乳制品中有害物质实物标样研究还很少。杨轶眉等[3]研究了奶粉蛋白质成分分析标准物质，奶粉经复溶、均质、干燥，均匀性良好，稳定性可达1年以上；李筱翠等[4]采用真空冷冻干燥-刀式混合研磨仪粉碎制备脱脂乳粉中硝酸盐、亚硝酸盐标样，其均匀性良好，常温长期稳定性良好。王向勇等[5]研制了牛乳中二噁英类化合物标准物质，通过冷冻干燥技术进行制备，其均匀性及室温条件1年内稳定性均良好。

氯酸盐是对人体有害的消毒副产物，乳粉生产过程所涉及的清洗和消毒都可能造成残留污染[6]；高氯酸盐是一种新型持久性化学污染物，饲料和饮水可造成乳粉源头污染[7]。近几年婴配乳粉中氯酸盐和高氯酸盐的检测方法已得到广泛研究[8-12]，但相关实物标样的研制国内外尚未有报道。此项目对婴配乳粉氯酸盐和高氯酸盐实物标样的制备技术进行研究，并对制备的标样进行评估。制备出的标样可为检测技术研究和质量安全分析提供保障，也可应用于分析方法验证和分析能力考核，同时也为政府监管提供科学、公正的依据和技术支持。

1 试验部分

1.1 仪器和试剂

1.1.1 仪器与设备

喷雾干燥机（SP-500，上海顺仪科技）；真空冷冻干燥机（LGJ-50FG，北京亚星仪科）；刀式混合研磨仪（德国Retsch）；样品混匀仪（瑞士Wab）；高效液相色谱-串联质谱仪（Xevo TQ-XS，美国Waters公司）；电子天平（MS204S，瑞士梅特勒托利多仪器公司）；超声清洗仪（SK8210HC，上海科导超声仪器有限公司）；涡旋振荡器（D-91126 Schwabach，德国Heidolph公司）；离心机（Centrifuge 5804，德国Eppendorf公司）。

1.1.2 试剂与材料

超纯水（质谱级，Fisher）；乙腈（质谱级，TEDIA）；甲酸（色谱级，TEDIA）；甲酸铵（液质联用级，ACS恩科）；甲醇（色谱级，MERCK）；氯酸盐标准溶液（有证标准物质，Inorganic Ventures）；高氯酸盐标准溶液（有证标准物质，Inorgani c Ventures）；氯酸盐标准溶液（有证标准物质，SIGMA）；高氯酸盐标准溶液（有证标准物质，SIGMA）；氯酸盐同位素内标溶液（美国CIL）；高氯酸盐同位素内标溶液（美国CIL）；婴幼儿配方乳粉基粉（某乳粉公司提供）。

1.2 标准样品的制备

1.2.1 复原乳的配制与目标物质的添加

在超纯水中加入氯酸盐和高氯酸基础含量明确的婴幼儿配方乳粉，乳固体含量为33%。按设定添加量依次加入氯酸盐、高氯酸盐标准溶液，以100 MPa高压均质2次。

1.2.2 乳粉的干燥和混匀

为降低对氯酸盐和高氯酸盐含量的影响，以进风温度140 ℃喷雾干燥，得含水率约4.0%的乳粉；再经温度45 ℃、真空度0.09 MPa真空干燥15 h，得含水率在2%以内的乳粉，样品取出后使用刀式混合研磨仪粉碎。

1.2.3 封装

每份包装实物标准样品的质量为8 g，采用内袋铝箔袋密封条包装、外袋铝箔袋充氮热封的双层包装分装样品。

1.3 标准样品氯酸盐和高氯酸盐含量的检测

1.3.1 样品前处理

称取2 g试样置于50 mL具塞离心管中，加入氯酸盐和高氯酸盐同位素内标液，准确加入5.0 mL 0.1%甲酸水溶液，立即涡旋振荡5 min，置于45 ℃水浴超声30 min，再准确加入10.0 mL乙腈，混匀，以10 000 r/min离心10 min，取上清液，过0.22 μm滤膜，待测。

1.3.2 绘制标准曲线

用20 mmol/L甲酸铵-乙腈（1∶2）溶液将标准溶液进行逐级稀释，加入与样品提取液等含量的内标溶液，配制成氯酸盐5，10，20，50和100 μg/L，高氯酸盐2.5，5，10，25和50 μg/L的混合标准溶液，每个质量浓度点重复测定2次，绘制标准曲线。

1.3.3 高效液相色谱-串联质谱仪工作条件

色谱柱，Themo Acclaim TRINITY P1（50 mm×2.1mm，3 μm）；柱温，35 ℃；进样体积，5 μL；流速，0.3 mL/min；流动相，乙腈（A）-20 mmol/L甲酸铵（B）；梯度洗脱，A-B初始比例68∶2，3 min时变为90∶10；离子源，电喷雾离子源；毛细管电压，200 V；离子源温度，150 ℃；脱溶剂温度，400 ℃；脱溶剂气流量，900 L/h；锥孔气流量，150 L/h；采用多反应监测（MRM）模式采集数据。氯酸根定量离子对：母离子m/z83.0，子离子m/z67.0。高氯酸根定量离子对：母离子m/z99.0，子离子m/z83.0。

1.4 标准样品均匀性检验

根据GB/T 15000.3—2008《标准样品工作导则（3）定值的一般原则和统计方法》[13]要求，在制备的标准样品中随机抽取10袋，每袋取2份平行样品，进行组内均匀性和组间均匀性检验，以随机顺序对每份样品进行重复测定，用单因素方差分析法进行均匀性评估，并计算均匀性引入的不确定度。

1.5 标准样品稳定性监测

根据GB/T 15000.3—2008《标准样品工作导则（3）定值的一般原则和统计方法》要求，随机抽取12份样品，每3份分别置于-25，0，20和40 ℃的恒温环境中，在第1，第3和第7天取出进行测定，监测标准样品的短期稳定性；按照先密后疏的原则，在室温条件下保存0，0.5，1，3，6和12个月时随机抽取1袋进行长期稳定性监测，采用t-检验法线性回归趋势分析，对稳定性监测结果进行评估。

2 结果与讨论

2.1 标准样品制备和封装工艺的选择

在乳粉复溶过程中，要考虑原料乳粉的充分溶解性，以便在添加氯酸盐和高氯酸盐后能够达到良好的混合程度，同时又要考虑到后续喷雾干燥所能承受的水分含量。试验表明，乳粉冲调质量分数在30%～35%时可以达到良好的溶解效果，而不影响后续干燥步骤的实施。

由于乳粉中脂肪和蛋白质含量都相对较高，所以制备的乳粉成品中水分含量不宜过高，以防止储存过程中的结块和变质。经过对市售乳粉和喷雾干燥成品的检测和研究，乳粉水分含量在2%以内时，乳粉黏度适中，易于存放。同时，考虑到高氯酸盐化学性质相对稳定，而氯酸盐的氧化性较强，在高温条件下可能转化为高氯酸盐，所以在干燥过程采用低进风温度喷雾干燥和真空干燥复合干燥技术。首先采用低进风温度喷雾干燥，使乳粉中的水分含量小于5%，而后用真空干燥技术，使乳粉成品的水分含量小于2%。试验考察了进风温度130，135，140和145 ℃时的干燥效果和对目标物质的影响，当进风温度为130 ℃时，制备的乳粉水分含量在5.3%左右，氯酸盐损失率最小，但后续的真空干燥过程需在45 ℃、真空度0.09 MPa下进行24 h，才能使乳粉成品的水分含量小于2%；当进风温度为140 ℃时，制备的乳粉水分含量在4.2%左右，氯酸盐稍有损失，但损失率不大，而后续的真空干燥过程可缩短至15 h；当进风温度提高至145℃时，虽然制备的乳粉水分含量减小，但会使氯酸盐损失增大。故采用进风温度140 ℃喷雾干燥，45 ℃、真空度0.09 MPa真空干燥15 h作为干燥条件。

在样品封装时，考察了真空塑封包装、瓶装以及铝箔袋充氮包装等3种工艺的储存效果。结果表明，真空塑封包装在室温保存3个月左右时，乳粉发生结块现象，不适于后续的分析使用；在瓶装包装中，虽可长期室温保存，但是瓶口一旦打开，就很难保证乳粉的长期保存且不结块变质；采用内袋铝箔袋密封条包装，外袋铝箔袋充氮热封的双层包装分装样品，内袋乳粉每袋4 g单独密封条包装，便于使用，每2个内袋再采用外袋充氮包装，便于长期室温保存。

2.2 标准样品检测方法的优化

检测方法在比较了离子色谱-串联质谱和高效液相色谱-串联质谱两种方法后，采用了稳定性更好、目前应用范围更广的高效液相色谱-串联质谱法，并参考国家补充检验方法BJS 201706《食品中氯酸盐和高氯酸盐的测定》[14]，对检测条件进行了优化。

样品在加入甲酸提取溶液后，要立即进行充分混合，以便乳粉全部溶解，达到良好的提取效果。由于乳粉黏性较大，由液体包裹的乳粉块如果不充分溶解，会影响结果的精密度，普通的振摇很难使乳粉充分溶解，试验加入了涡旋振荡5 min，以达到良好的平行试验效果。

试验考察了不同超声时间（10，20，30和40 min）对结果的影响。结果表明，超声30 min较10 min和20 min有更好的回收率效果，而超声40 min时回收率增加不明显，故采用超声时间30 min。

试验对流动相配比进行了研究。BJS 201706中流动相初始比例乙腈（A）-20 mmol/L甲酸铵（B）为35∶65，而后B项逐渐减少至10%，在此条件下，氯酸盐和高氯酸盐的出峰较靠后，而后续被冲出的杂质会在目标峰附近形成一定干扰；经试验研究，将流动相A-B初始比例调整为68∶32，3 min时B项减少至10%，在此条件下，氯酸盐和高氯酸盐会较早出峰，而杂质在后续出峰，避免了对目标物质的干扰，同时20 mmol/L甲酸铵比例相对减少，也降低了盐类对离子源锥口的污染，提高了检测的长期稳定性。

2.3 标准样品均匀性检验和评估

采用单因素方差分析法，按照优化的检测条件对标准样品进行检测，结果见表1。结果显示，标准样品测定结果符合公式FA＜F0.05（9，10），此项研制的实物标准样品组内与组间无明显差异，说明标准样品是均匀的。由于组内方差小于组间方差，所以利用检测方法重复性方差来评估样品均匀性引入的不确定度，乳粉样品中氯酸盐与高氯酸盐均匀性引入的不确定度（ubb）分别为1.00和0.456 μg/kg。

表1 婴幼儿配方乳粉氯酸盐和高氯酸盐实物标准样的均匀性检验结果

2.4 标准样品短期稳定性监测和评估

采用线性回归趋势分析t-检验法，对其短期稳定性进行监测，结果见表2。短期稳定性监测的目的主要是考察标准样品在后续使用时，运输过程是否会对目标物质造成影响。考虑到环境温度的高温和低温，以及运输时间，试验考察了-25，0，20和40 ℃时保存1周的影响。结果表明，在4个温度条件下，标准样品中氯酸盐和高氯酸盐稳定性良好。

表2 标准样品短期稳定性监测结果和统计参数

2.5 标准样品长期稳定性监测和评估

采用线性回归趋势分析t-检验法，按照预定的时间间隔，对标准样品的长期稳定性进行监测，结果见表3。由于氯酸盐和高氯酸盐在常温下化学性质相对稳定，所以主要考察室温条件下标准样品的储存效果。在12个月的监测周期内，标准样品氯酸盐和高氯酸盐特性值带入结果均为│b1│＜t(0.95,4)×s(b1)，表明标准样品目标成分在12个月内不具备长期变化趋势。

表3 标准样品长期稳定性监测结果和统计参数

2.6 标准样品制备回收率的评估

对原料乳粉和经过基质添加制备的乳粉标准样品进行氯酸盐和高氯酸盐检测，为了排除检测过程中回收率对结果造成的影响，对测得结果均进行加标回收率校正，结果见表4。结果表明，标准样品中氯酸盐和高氯酸盐的测得值与实际添加值较为吻合，制备回收率分别为93.5%和98.4%。

表4 标准样品的制备回收率

3 结论

此次试验制备了婴幼儿配方乳粉氯酸盐和高氯酸盐标准样品，经乙腈沉淀蛋白-高效液相色谱-串联质谱法检测氯酸盐和高氯酸盐含量，采用单因素方差分析法进行均匀性评估，结果符合FA＜F0.05（r-1,n-r），采用线性回归趋势分析t-检验法进行稳定性评估，结果符合│b1│＜t(0.95,n-2)×s(b1)，氯酸盐和高氯酸盐的制备回收率分别为93.5%和98.4%，证明所制备的标准样品具有氯酸盐和高氯酸盐含量均匀、短期和长期稳定性良好、目标制备值与实际检测值相吻合的优点，可作为婴幼儿配方乳粉氯酸盐和高氯酸盐检测的对照标准样品。