蛋白酶A作用纯生啤酒泡持性的影响因素

宋健

沈阳市食品药品检验所理化检验室（沈阳 110136）

啤酒泡沫是啤酒的重要特征指标之一，是衡量啤酒特性[1]的一个重要方面。良好的泡沫性[2-3]不但能提高啤酒清凉爽口的口感，还是优良啤酒的一个显著评判标准，啤酒泡沫的性能主要表现在啤酒的起泡性、外观、泡沫的持久性及泡沫挂杯质量[4-5]。纯生啤酒由于不经过热杀菌、未受氧化，所以最大限度地保持了啤酒的新鲜度、风味物质和营养价值，深受广大消费者的喜爱。同时因为未经过热杀菌处理从而残留一些酶类[3-5]而造成纯生啤酒的泡沫持久性降低[6]，这是各企业及国内外研究学者关注的焦点问题。国内外的研究学者研究认为这是由于酒液中存在的蛋白酶A[7-9]及蛋白酶A前驱物[10]从而破坏泡沫的蛋白造成的。啤酒中含有的来自麦芽等原料的蛋白质和多肽[11-13]，它们能够聚集并起到表面活性剂的作用，同时增强气泡的表面黏性和稳定性[14-15]。王德良等[16]通过分析啤酒泡沫的作用机理和生产工艺，研究蛋白酶A对成品啤酒的泡沫稳定性的影响。Hiroto等[17]借助荧光底物法研究发现发酵过程中氨基酸含量低时，酵母能释放更多的蛋白酶A以保持泡沫稳定性。张吉磊等[18]利用BCA法和电泳技术研究出异-α酸和蛋白含量对啤酒泡持性的影响。目前对于纯生啤酒的研究主要为其贮存[19]和发酵[20-21]过程中蛋白酶A和高分子蛋白[22]含量的变化趋势，而对于啤酒泡沫稳定性影响条件的相关机理的研究较少。

此次试验通过研究纯生啤酒不同加工和贮存条件下泡沫保持性的变化规律和作用机理，分析影响啤酒泡持值的关键因素，为改善啤酒泡泡沫稳定性提供可行性参考和建议。

1 试验材料和方法

1.1 试验材料与试剂

雪花纯生啤酒（原麦汁浓度为10 °P），华润雪花啤酒（沈阳）有限公司生产；无水乙醇，国药集团化学试剂有限公司；牛血清蛋白，上海伯奥生物科技有限公司；磷酸氢二钠、柠檬酸，国药集团化学试剂有限公司；荧光底物MOCAc-Ala-Pro-Ala-Lys-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys（Dnp）-NH2，日本多肽研究所；蛋白酶K。

1.2 试验仪器与设备

ZMP-P啤酒浊度泡沫测定仪（成都天平仪器厂））；HH-4数显恒温水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；970CRT荧光分光光度计（上海三科仪器有限公司）；H-2050R型冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；高效液相色谱测定仪（Waters e2695）。

1.3 啤酒泡持性的测定

参照GB/T 4928—2008中仪器法（Nibem法）测定成品啤酒泡持值，平行检测3次，取平均值。

1.4 泡沫形成液的提取

纯生啤酒待测样沿漏斗边缘匀速倒入1 L的分液漏斗，使泡沫达850 mL为止，加盖5 s后打开出样阀，让啤酒残夜放至恰有泡沫流出，并控制在60 s内放完，关闭阀门，得到泡沫生成液。

1.5 蛋白酶A活力检测方法

取离心管，加入500 μL pH 5.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，加入440 μL去离子水，再加入40 μL经过除气的待测纯生啤酒样品，最后加入20 μL 0.2 mmol/L荧光底物。混合均匀后，在避光条件下将离心管盖紧，放入30 ℃水浴中反应30 min。反应结束后取出离心管，放入80 ℃水浴中灭活3 min。取出后将样品迅速冷却至0 ℃，以10 000 r/min冷冻离心3 min。

处理后的样品移取750 μL测定其荧光强度，根据相关文献及研究，确定仪器条件：激发波长λex=328 nm，发射波长λem=393 nm。空白啤酒样品需先在80 ℃水浴中保温10 min灭活蛋白酶A，其他处理过程同检测样品。

由于没有蛋白酶A标准样品，查询相关文献可知蛋白酶K与其特征相似，二者作用荧光底物时破坏两个苯丙氨酸键基本一致，所以用蛋白酶K来做标准曲线回归方程，再检测样品的荧光度，根据荧光强度计算样品中蛋白酶A活力。

1.6 疏水性多肽分析检测

疏水蛋白的提取与纯化：将待测酒样沿漏斗边缘匀速倒入1 L的分液漏斗，至泡沫达到800 mL；10 s后打开放样阀，让液体放出至刚好有泡沫流出，立即关闭放样阀，低温处理消泡，得到泡沫生成液。将硫酸铵缓缓加入100 mL泡沫生成液中，使溶液中的硫酸铵饱和度接近80%，静置1 h后，设定仪器条件（10 000 r，15 min，20 ℃），离心，弃上清液，取沉淀蛋白待下一步分析。配制25%硫酸铵溶液沉淀蛋白，将溶解后的蛋白通过输水柱进行层析分离。将输水性凝胶填料Octyl-Sepha-rose CL-4B装入柱中，用25%饱和硫酸铵清洗并平衡柱子。吸取上清液，用25%硫酸铵洗脱柱子，首先未结合到柱上的弱疏水性蛋白先被洗脱下来，然后继续用去离子水洗脱柱子，中等疏水蛋白被洗脱下来，最后用50%的异丙醇洗脱，则强疏水性蛋白被洗脱下来，分离得到的所有分组都进行透析，得到产物并冷冻干燥。疏水性多肽检测方法采用高效液相色谱分析法。采用Waters e2695 HPLC仪，Syncronis C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，SPD-M20A二极管阵列检测器，流动相为pH 7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓存溶液，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量10 μL；检测波长280 nm。

2 结果与分析

2.1 温度对纯生啤酒泡沫性影响

根据相关研究[23-24]，啤酒蛋白酶A在20～40 ℃之间活性最强，试验在不同温度下测定纯生啤酒泡沫稳定性以寻求最优强化温度，如图1所示。温度对纯生啤酒泡沫的稳定性影响显著，纯生啤酒的泡沫稳定性随着时间的演唱呈下降趋势。当贮存温度为25 ℃时，啤酒泡沫稳定性变化较慢，随着贮存温度的增加，啤酒泡沫稳定性下降趋势明显，在37 ℃和40 ℃下泡持值降至150 s左右。

图1 纯生啤酒样品在不同温度下的泡持变化趋势

2.2 纯生啤酒在不同温度下存放过程中蛋白酶A的变化

由图2可知，当贮存温度为37 ℃和40 ℃时，蛋白酶A有一定的上升趋势，泡持性与蛋白酶A含量存在一定的负相关。根据张彦青等[7]的相关研究，纯生啤酒泡沫衰减主要受蛋白酶A影响，在贮存后期啤酒泡沫稳定性的变化主要由蛋白酶A的前驱物所作用。蛋白酶A在温度较高环境下活性有所增强，啤酒泡持性下降明显。

图2 纯生啤酒样品在不同温度下蛋白酶A变化趋势

2.3 纯生啤酒贮存过程中的泡持性

选取同一批次生产的纯生啤酒和经杀菌处理的对照样品，跟踪测定其贮藏过程中的泡沫保持性，结果如图3所示。纯生啤酒存放过程中，泡沫稳定性不断衰减。其中12 ℃贮存的纯生啤酒放1个月时泡持性下降约12%，降幅较小；而25 ℃和35 ℃贮存的纯生啤酒泡持时间下降约30%。存放2个月时，3种贮存温度下的纯生啤酒泡持时间分别下降至103，74和62 s。存放3个月时啤酒泡沫泡持时间均降到不足50 s。结果表明，纯生啤酒在较低贮存温度下，泡沫稳定性能维持约1个月，而温度较高条件下，存放1个月时泡持性下降趋势明显；25 ℃和35 ℃条件下存放2个月，12 ℃存放3个月时，纯生啤酒的泡沫稳定性能已经变得很差。而同样温度下贮存的经灭菌处理的纯生啤酒对照样品，其泡持值虽然随时间有所下降，但3个月后下降程度比纯生啤酒要小很多。

图3 纯生啤酒与对照样品存放过程中泡持性的变化对比

2.4 蛋白酶A对麦汁疏水多肽的关系研究

试验研究不同麦汁浓度下，即不同蛋白酶A含量下，疏水多肽随时间的变化情况，20 ℃反应144 h，每24 h取样1次，利用疏水作用色谱对麦汁中的多肽进行分析。结果如图4所示。试验表明，随着时间的推移，多肽含量呈显著下降趋势，前期变化较快，后期呈缓慢下降。此种变化规律主要是因为啤酒中蛋白酶A的含量呈下降趋势，对疏水多肽的影响减弱；另外一部分疏水多肽对蛋白酶A产生抗性[11]。

图4 不同麦汁浓度下疏水多肽含量变化趋势

3 结论

此次试验主要研究蛋白酶A在不同条件下对纯生啤酒泡沫持久性的影响。蛋白酶A作为影响啤酒泡持性的关键因素，在不同影响因素下展现出差异化的作用效果。在低温条件下短期内贮存啤酒泡持性不会降低很多，但在25 ℃以上随着储存时间的延长，纯生啤酒的泡持性会迅速下降，从而影响啤酒的饮用品质。纯生啤酒存放过程中蛋白酶A活性、泡持性均出现衰减趋势且变化比较明显。尽管蛋白酶A对纯生啤酒中疏水多肽的水解活性影响较弱，但作用时间较长，在一定时间内会导致纯生啤酒泡沫稳定性显著下降，但在一定时期后蛋白酶A影响作用明显减弱，这可能是由于部分疏水蛋白对蛋白酶A产生抗性。蛋白酶A对纯生啤酒泡持性作用受多种因素综合影响，在纯生啤酒制作过程中需要综合考虑，以达到啤酒泡持性最佳状态。