LM609联合TBBPA对斑马鱼神经行为毒性的影响

李佳妮，陈将飞，董昊嘉，王红珠，史清玉，喻家健，黄长江

(温州医科大学，浙江 温州 325000)

四溴双酚A(TBBPA)是一种广泛使用的溴代阻燃剂[1]，常被应用于各种塑料制品，在日常生活中常有添加，如母婴制品、工业制品等，在环境中有较高剂量的存在[2]。有研究表明，TBBPA在使用及降解过程中对水源、空气等环境造成污染，从而间接进入人体，极微小的剂量就可引起毒性反应，引起生物体的神经毒性，且毒性效应会根据发育时期的不同而改变，但其毒性机制尚不明确。研究发现，TBBPA是甲状腺激素(T4，四碘甲状腺原氨酸)的结构类似物[3]。T4是一种氨基酸衍生物，在生物体遭受刺激时，下丘脑释放促甲状腺激素释放激素(TRH)刺激垂体，垂体前叶收到刺激产生促甲状腺激素(TSH)，TSH进一步刺激甲状腺释放T4，T4通过αVβ3信号通路发挥作用[4]。因此，有学者认为，当TBBPA进入生物体后，会与T4受体竞争性结合，影响αVβ3信号通路，使得该信号通路紊乱，影响机体正常的生命活动。在动物体内，Anti-Integrin αVβ3 抗体(LM609)是一种能阻断αVβ3整合素与纤维黏连素结合的抗体[5]，能够在一定程度上阻断αVβ3信号通路，因此，我们猜想LM609的添加可在一定程度调节因TBBPA导致的αVβ3信号通路的紊乱，挽救TBBPA的神经毒性。

斑马鱼是一种新型的模式生物，相比于啮齿动物而言，斑马鱼具有体型小、易繁殖的特点。斑马鱼的胚胎在体外发育，易观察易操作，可实时记录斑马鱼胚胎发育的动态过程，适合进行多种体外实验，且目前斑马鱼的实验技术均已成熟，如斑马鱼胚胎行为学实验、斑马鱼胚胎显微注射[6]、斑马鱼基因突变体构建[7]等。因此，斑马鱼在毒理学研究、神经行为学研究等方面均有卓越的优势。在本实验中，我们进行了斑马鱼自主运动实验、接触反应实验、光暗周期实验，以比较LM609添加前后TBBPA的毒性效应，从而评价LM609与TBBPA联合暴露对斑马鱼胚胎的神经毒性影响，进而明确TBBPA进入生物体产生毒性的机制是否与αVβ3信号通路有关[8]。通过本研究，可以为溴代阻燃剂的合理使用提供指导，也为溴代阻燃剂造成的临床疾病治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

实验所用斑马鱼为来自美国俄勒冈州立大学斑马鱼实验室的野生型AB品系斑马鱼，饲养于全封闭式水循环系统，光暗周期设置为14 h光照、10 h黑暗，喂食孵化完全的丰年虫，每日2次，每次间隔12 h左右，20 d龄以下的幼鱼喂食专用的幼鱼饲料[9]。

1.1.2 实验试剂

本研究所用试剂主要有纯度为100%的Anti-Integrin αVβ3 抗体(LM609)(Ab190147，Abcam)，纯度≥99%的TBBPA(分子量为543.87 u，79-94-7，Aldrich)，分析纯的二甲基亚砜(DMSO)(分子量为78.12 u，67-68-5，上海展云化工有限公司)。

1.1.3 实验仪器

全封闭式斑马鱼循环系统Aquatic Habitats Stand-Alone System(美国AHAB公司)；斑马鱼光照恒温胚胎培养箱(RXZ-300C，宁波江南仪器厂)；体式显微镜(Nikon SMZ1500，上海千欣仪器有限公司)。

1.2 实验试剂的配制

实验药品的配制：使用1×PBS缓冲液将LM609稀释至50 μg·mL-1工作液，以酚红为指示剂用于显微注射；TBBPA先用DMSO配制2 mmol母液，使用时将其稀释1 000倍即为2 μmol工作液；对照组使用千分之一浓度的DMSO处理。

胚胎培养液(EM)的配制：称取0.8 g NaCl，0.04 g KCl，0.003 58 g Na2HPO4，0.006 g KH2PO4，0.144 g CaCl2，0.246 g MgSO4·7H2O，0.35 g NaHCO3，800 mL超纯水置于1 L烧杯中，超声搅拌至澄清，再用超纯水定容至1 L，滴加1 mol NaOH溶液调pH至7.2即可。

1.3 斑马鱼胚胎的收集及前期处理

提前2～3 d对斑马鱼雌雄分缸喂养并加餐，在收集斑马鱼胚胎的前一晚，按照雌鱼∶雄鱼1∶1的比例将斑马鱼分别放置于孵化框中，避光放置并插好挡板，第二日早上10点将挡板拔掉，并将孵化框置于阳光处，雄鱼将追尾雌鱼进行交配，约20 min后交配结束，收集胚胎。将胚胎用胚胎培养液清洗3遍后，挑出状态不好的胚胎，其余胚胎置于胚胎培养箱中培养，每日检查胚胎状态，及时将死亡胚胎挑出，并更换新的培养液。

1.4 斑马鱼胚胎显微注射LM609

在收集并清洗斑马鱼胚胎后，在显微镜下及时挑选出健康的胚胎，1 h内的胚胎为单细胞期，挑选单细胞期的斑马鱼胚胎，将其逐个排列在显微注射板上，用于显微注射。显微注射使用6 μL体系，即酚红指示剂1 μL与5 μL的LM609工作液，混匀后将其注射至斑马鱼胚胎的卵黄囊中，在显微镜下可明显观察到斑马鱼胚胎卵黄囊部分有淡红色晕块即为注射成功。10 min后在显微镜下观察，挑出状态不好及死去的斑马鱼胚胎，剩余斑马鱼胚胎置于添加1‰双抗的胚胎培养液中培养。

1.5 斑马鱼胚胎暴毒及神经行为实验

1.5.1 斑马鱼胚胎暴毒

设置对照组、2 μmol TBBPA暴露组、50 μg·mL-1LM609暴露组、TBBPA联合LM609暴露组共4组，前2组使用野生型斑马鱼胚胎进行暴毒，后2组使用注射LM609的斑马鱼胚胎进行暴毒，暴毒窗口设置为8～48 hpf(hours post fertilization，受精后小时数)。在斑马鱼胚胎半胞期即8 hpf时进行暴毒，将发育健康的野生型斑马鱼胚胎和显微注射LM609的斑马鱼胚胎分别置于6孔板中，每孔30枚胚胎，每组设置3个孔即为3个重复，每孔5 mL暴毒液，对照组则用1‰ DMSO作为对照，盖好保鲜膜避免暴毒液的挥发，将其置于胚胎培养箱中培养。

胚胎于48 hpf时脱毒，将暴毒液吸出后用EM清洗3次，每孔加入5 mL EM后盖上新的保鲜膜，置于胚胎培养箱中培养以待后续实验。斑马鱼胚胎约在72 hpf时全部脱膜，及时将脱掉的胚胎膜挑出，待5 dpf(Days post fertilization，受精后天数)后将发育良好的斑马鱼仔鱼转移至容量为2 L的幼鱼缸中饲养，每天喂食3次适量小鱼饲料，及时观察斑马鱼幼鱼的发育状态，并将死掉的仔鱼挑出。

1.5.2 斑马鱼行为实验

在18～24 hpf时，每2 h记录各暴毒组斑马鱼胚胎的摆尾次数作为自主运动数据，每组记录60条鱼。

在48 hpf时，先将各组斑马鱼胚胎脱毒后，用链霉蛋白酶脱膜后，用针灸针轻轻触碰斑马鱼仔鱼的尾部，记录其受到触碰后的运动距离，作为斑马鱼的触摸反应实验数据。

斑马鱼光暗周期实验挑选各组健康的、发育良好的、无肉眼可见畸形的斑马鱼仔鱼进行，行为实验使用ViewPoint Zebra-Lab行为仪[10]。斑马鱼幼鱼5 dpf的运动速度实验用24孔板，在屏幕上绘制出24个与孔板重合的大小形状相同的圆形，24孔板每孔加入1.5 mL的超纯水。每组挑选24条发育健康的活跃幼鱼，用巴氏滴管转移到上述的备好的24孔板中，每孔1条幼鱼。将每个暴毒组都依次准备好并记录，于光照恒定、温度恒定(28 ℃)的安静环境中适应20～30 min，于120 hpf(上午10点)开始实验。

Tracking模式参数为：背景像素20 pixels；速度1.5～3.0 mm·s-1；每隔60 s数据输出；程序光周期强度或持续光照强度为100%(500 1x)。每个程序设置为5 min光照、5 min黑暗、5 min光照、5 min黑暗、5 min光照，共计25 min。

1.6 数据分析

实验中所有数据均使用GraphPad Prism 6.0软件进行统计分析及作图。数据描述方法若无特殊说明，使用均值±标准差表示。数据先进行Shapira-Wikinson正态性检验和方差齐性检验，符合正态分布且方差齐则进行独立样本t检验和单因素方差分析，若不符合正态分布或方差不齐，对数据进行Welch法近似t检验或非参数检验；当统计检验水平为P<0.05时，认为有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 LM609联合TBBPA暴露对斑马鱼胚胎自主运动的影响

LM609联合TBBPA暴露至18～26 hpf时，对各组的斑马鱼胚胎进行了自主运动实验(图1)。18 hpf时，各组斑马鱼胚胎的自主运动次数趋近于0，与对照组相比，仅2 μmol TBBPA联合50 μg·mL-1LM609暴毒组自主运动次数上调且有显著性差异；2 μmol TBBPA暴毒组与50 μg·mL-1LM609暴毒组自主运动次数无显著性差异。20 hpf时，较18 hpf斑马鱼胚胎自主运动次数增多(图1中A)；2 μmol TBBPA暴毒组与对照组相比，自主运动次数显著性上调；LM609暴露组斑马鱼胚胎的自主运动次数与对照组相比无显著性差异；2 μmol TBBPA联合50 μg·mL-1LM609暴毒组斑马鱼胚胎的自主运动次数与对照组相比无显著性差异(图1中C)。22 hpf时，较20 hpf斑马鱼胚胎自主运动次数增多(图1中A)；2 μmol TBBPA暴毒组与对照组相比，斑马鱼胚胎的自主运动次数显著上调；50 μg·mL-1LM609暴露组、2 μmol TBBPA联合50 μg·mL-1LM609暴毒组斑马鱼胚胎的自主运动与对照组相比无显著性差异(图1中D)。24 hpf时，斑马鱼胚胎自主运动次数最多(图1中A)；与对照组相比，2 μmol TBBPA暴毒组斑马鱼胚胎自主运动次数明显上调且有显著性差异；50 μg·mL-1LM609暴露组、2 μmol TBBPA联合50 μg·mL-1LM609暴毒组自主运动次数增多，但与对照组相比均无显著性差异(图1中E)。26 hpf时，斑马鱼胚胎自主运动次数开始下调(图1中A)；与对照组相比，2 μmol TBBPA暴毒组自主运动次数明显上调且有显著性差异；50 μg·mL-1LM609暴露组、2 μmol TBBPA联合50 μg·mL-1LM609暴毒组自主运动次数稍多，但均无显著性差异(图1中F)。各暴毒组斑马鱼胚胎自主运动趋势呈抛物线式，在24 hpf时各组斑马鱼胚胎自主运动次数均达到最高值，之后开始下调。总体而言，2 μmol TBBPA暴毒组斑马鱼胚胎自主运动次数明显上调且有显著性差异。自主运动的结果表明，联合暴露组挽救了因TBBPA所造成的斑马鱼自主运动的增多，LM609对TBBPA的自主运动毒性效应具有挽救效应。

2.2 LM609联合TBBPA暴露对斑马鱼接触反应的影响

50 μg·mL-1LM609联合TBBPA暴露至48 hpf时，对各暴毒组的斑马鱼胚胎脱膜后进行了接触反应实验，每组检测24条鱼。对照组斑马鱼仔鱼的接触反应距离达到(22.07±2.458)mm；2 μmol TBBPA暴毒组斑马鱼仔鱼的接触反应距离降低至(13.46±0.688)mm，与对照组相比具有显著性差异；50 μg·mL-1LM609暴毒组斑马鱼仔鱼的接触反应距离上调，达到(22.27±2.391)mm，但是与对照组相比无显著性差异；2 μmol TBBPA联合50 μg·mL-1LM609暴毒组斑马鱼仔鱼的触摸反应距离上调为(25.74±2.541)mm，与对照组相比无显著性差异(图2)。结果表明，2 μmol TBBPA暴露导致斑马鱼仔鱼的触摸反应距离显著下调，2 μmol TBBPA联合50 μg·mL-1LM609暴毒则使得斑马鱼仔鱼的触摸反应距离上调，LM609对TBBPA所导致的接触反应毒性作用具有挽救效应。

2.3 LM609联合TBBPA暴露对斑马鱼运动速度的影响

50 μg·mL-1LM609联合TBBPA暴露至48 hpf脱毒后，于EM中培养至5 dpf时，对各暴毒组的健康的斑马鱼仔鱼进行了光暗周期的实验，每组检测24条鱼。实验结果发现，在光照情况下，对照组的斑马鱼仔鱼自由游泳速度为(1.576±0.043 25)mm·s-1；2 μmol TBBPA暴毒组的斑马鱼仔鱼自由游泳速度为(1.164±0.033 57)mm·s-1，与对照组相比显著下调；50 μg·mL-1LM609暴毒组的斑马鱼仔鱼自由游泳速度为(1.693±0.035 52)mm·s-1，与对照组相比无显著性差异；2 μmol TBBPA联合50 μg·mL-1LM609暴毒组的斑马鱼仔鱼自由游泳速度为(1.490±0.041 47)mm·s-1，与50 μg·mL-1LM609单独暴毒组相比显著下调，与对照组相比无显著性差异(图3中A)。在黑暗情况下，各暴毒组斑马鱼仔鱼的自由游泳速度均较光照情况上调，对照组的斑马鱼仔鱼自由游泳速度为(1.938±0.033 96)mm·s-1，2 μmol TBBPA暴毒组的斑马鱼仔鱼自由游泳速度为(1.736±0.032 02)mm·s-1，与对照组相比显著性下调；50 μg·mL-1LM609暴毒组的斑马鱼仔鱼自由游泳速度为(1.737±0.045 56)mm·s-1，与对照组相比显著性下调；2 μmol TBBPA联合50 μg·mL-1LM609暴毒组的斑马鱼仔鱼自由游泳速度为(1.851±0.032 04)mm·s-1，与对照组相比无明显差异，与50 μg·mL-1LM609单独暴毒组相比上调(图3中B)。所有的暴毒组在黑暗条件下的自由游泳速度均高于光照条件下的自由游泳速度，趋势保持稳定。光暗周期实验表明，联合暴露能够挽救TBBPA导致的斑马鱼光暗情况下自由游泳速度的下调，且在光照条件下挽救上调作用更加明显。

18～26 hpf斑马鱼胚胎自主运动数据，检测指标为斑马鱼胚胎在各个时间发育节点的摆尾次数；A—各组斑马鱼胚胎自主运动趋势图；B～F—各组斑马鱼胚胎在不同的时间发育节点摆尾次数；*—代表不同处理间有显著性差异，不同处理间标有不同字母代表处理间有显著性差异，P<0.05。图2～3同。图1 联合暴露对斑马鱼胚胎自主运动的影响

图2 48 hpf时斑马鱼仔鱼接触反应

A—斑马鱼仅在光照情况下的自由游泳速度；B—斑马鱼仅在黑暗情况下的自由游泳速度。图3 5 dpf时斑马鱼仔鱼自由游泳速度

3 讨论

目前对于单独化合物[11]的毒理学效应研究较多，但是对于其机制研究的较少，化合物进入机体内是以何种途径转化继而发挥毒性效应的，这才是化合物暴露的研究重点。近年来，随着斑马鱼胚胎显微注射技术的不断成熟，使得一些不易体外暴露产生效应的物质，如抗体、激素等，很容易就能注射到斑马鱼胚胎的卵黄囊内，继而发挥效应。使得我们在研究化合物暴露的机体效应时，能够将一些与化合物机体效应途径相关的激素或者抗体等注射进入斑马鱼胚胎内，使其联合暴毒，可能会对化合物在机体内的转化效应产生干扰，以明确化合物的致毒机制[12]，以便后续为该化合物的治疗提供思路和参考。

斑马鱼的自主运动主要是斑马鱼尾部的摆动[13]，与斑马鱼的次级神经元无关，是受到斑马鱼初级神经元支配的运动[14]，不依赖斑马鱼的脑部神经元，是可检测的最早的神经行为[15]。触摸反应也是如此。斑马鱼自主运动一般在19 hpf时开始，TBBPA暴毒导致胚胎自主运动次数明显增多，接触反应运动距离减少；LM609与TBBPA的联合暴露则使得斑马鱼胚胎的自主运动和触摸反应恢复到正常值，LM609对TBBPA的神经毒性效应具有挽救作用。

斑马鱼5 dpf的光暗周期实验可以很准确的反应斑马鱼在光暗情况下的速度，是衡量斑马鱼肌肉及神经发育的一个很好的参数。实验表明，TBBPA暴露导致斑马鱼在光暗情况下的速度均降低，经LM609与TBBPA联合暴露后，斑马鱼的运动速度又恢复至正常值，挽救效应明显。

LM609作为一种能够阻断T4作用途径的抗体[16]，会使得机体内的甲状腺激素含量降低；TBBPA作为T4的结构类似物，进入机体后则会与T4受体结合[17]，可能会导致机体内T4的含量上升。而本研究表明，就斑马鱼的神经行为而言，LM609能够挽救因TBBPA所导致的毒性效应，则在一定程度上验证了TBBPA进入机体内后，是通过升高机体内的甲状腺激素含量发挥作用的。这就为后续治疗TBBPA所导致的神经行为毒性提供了理论支撑，同时，LM609显微注射的斑马鱼可作为一种T4研究的模式生物，也为甲状腺相关的研究和治疗提供了临床依据。