正交试验法优选益气活血颗粒水提工艺△

翁燕，范智毅，刘志辉*

1.南京中医药大学 附属医院，江苏 南京 210029；2.南京中医药大学，江苏 南京 210029

益气活血方来源于江苏省中医院，由黄芪、炙黄芪、党参、麦冬、五味子等中药组成，具有益气养阴、凉血散瘀的功效。该方在心内科门诊已使用多年，以中医药理论为指导组方，不含具有毒性的中药、无配伍禁忌、无药味超量，若按传统工艺制备，申报医疗机构制剂则可以免药效、毒理和临床研究资料[1]。本研究采用正交试验法对益气活血方进行水提取工艺优选，为其研究、开发及申报医疗机构中药制剂备案提供理论依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

KQ-1000E型医用超声波清洗仪(昆山市超声仪器公司)；e2695-2998型高效液相色谱仪(美国Waters公司)；Alltech-ELSD 2000型蒸发光散射检测器(美国Alltech公司)；WSK-A型自动空气发生器(天津市津分分析仪器制造有限公司)；AR2140型电子分析天平(美国Ohaus公司)。

1.2 试药

黄芪甲苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110781-201213)；毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品(南京宁歧医药科技有限公司，批号：150326)；乙腈、甲醇(色谱级，Merck公司)；甲酸(色谱级，ROE Scientific Inc)；水为超纯水；正丁醇和氨水为分析纯。

处方饮片均来自江苏省中医院药学部，由顾和亚主任中药师鉴定，均符合《中华人民共和国药典》2015年版。

2 方法与结果

2.1 黄芪甲苷的含量测定

2.1.1色谱条件 Hedera C18ODS-2色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-水(32∶68)；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；漂移管温度：103 ℃；载气流量：2.7 L·min-1[2-3]。

2.1.2溶液的制备 对照品溶液制备：精密称取黄芪甲苷对照品适量于量瓶中，以甲醇定容，得质量浓度为1.051 mg·mL-1的对照品溶液。

供试品溶液制备：量取益气活血方水提液30 mL，每次加入水饱和正丁醇溶液30 mL萃取，共4次。每次以40 mL氨试液充分洗涤合并得正丁醇液，共洗涤2次后，弃氨试液，取正丁醇液于水浴蒸干，甲醇溶解残渣，定容于10 mL量瓶中，取续滤液。

阴性样品溶液制备：取缺黄芪/炙黄芪阴性制剂，按供试品溶液制备方法操作，即得[4-6]。

2.1.3系统适用性试验 分别吸取2.1.2项下各溶液，注入高效液相色谱仪，按2.1.1项下色谱条件测定，得高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)图(图1)。结果表明，益气活血方供试品与对照品在相同保留时间处均有较大吸收，阴性无干扰。

注：A.对照品；B.供试品；C.阴性样品；1.黄芪甲苷。图1 益气活血方黄芪甲苷色谱图

2.1.4标准曲线 将黄芪甲苷对照品溶液，加甲醇稀释至质量浓度分别为1 051.00、840.80、525.50、262.75、131.38、105.10 μg·mL-1，按2.1.1项下色谱条件测定。得回归方程Y=1.694 1X+4.973 4(r=0.999 5)。结果表明，黄芪甲苷的检测进样量线性范围为1.051～10.51 μg。

2.1.5精密度试验 将质量浓度为262.75 μg·mL-1的黄芪甲苷对照品，按2.1.1项下条件进样6次测定，以黄芪甲苷峰面积计，RSD为0.45%，表明仪器精密度良好。

2.1.6稳定性试验 取同一益气活血方(批号：1607002)供试品溶液，按2.1.1项下条件，于供试品配制后0、2、4、6、8、12 h进样，测定，结果以黄芪甲苷峰面积计，RSD为3.54%，表明该方法12 h内稳定性良好。

2.1.7重复性试验 取同一批益气活血方样品(批号：1607002)，共6份，依2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.1.1项下色谱条件测定得黄芪甲苷平均质量分数为0.14 mg·g-1，RSD为4.92%(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.1.8加样回收试验 取已知指标成分含量的益气活血方样品6份，并精密加入黄芪甲苷对照品适量，依2.1.2、2.1.1项下方法制备、测定，结果见表1。

表1 黄芪甲苷加样回收率试验结果(n=6)

2.2 毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定

2.2.1色谱条件 HederaC18ODS-2色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相A：乙腈，流动相B：0.2%甲酸水溶液，梯度洗脱(0～10 min，10%～20%A；10～20 min，20%～30%A；20～25 min，30%A；25～27 min，30%～10%A；27～30 min，10%A)；检测波长为260 nm；流速为1.0 mL·min-1；柱温为30 ℃；进样量为10 μL[7-8]。

2.2.2溶液的制备 对照品溶液制备：精密称定毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，加甲醇制成对照品溶液，质量浓度为1.02 mg·mL-1。

供试品溶液制备：精密吸取益气活血方水提液2 mL，置10 mL量瓶中，加入甲醇适量使溶解并定容，取续滤液，即得。

阴性样品溶液制备：取缺黄芪/炙黄芪的阴性制剂，依“供试品溶液”方法制备缺黄芪/炙黄芪阴性溶液。

2.2.3系统适用性试验 取上述对照品溶液、供试品溶液及阴性溶液，按2.2.1项下条件测定，结果见图2。益气活血方供试品与对照品在相同位置均有较大吸收，且阴性无杂质干扰。

注：A.对照品；B.供试品；C.阴性样品；2.毛蕊异黄酮葡萄糖苷。图2 益气活血方中毛蕊异黄酮葡萄糖苷色谱图

2.2.4标准曲线 精密吸取上述对照品溶液，加甲醇稀释成质量浓度分别为255.000、127.500、25.500、12.750、6.375、3.188、1.594 μg·mL-1的对照品溶液，按2.2.1项下条件测定，得回归方程Y=23 473X+25 945(r=0.999 9)。毛蕊异黄酮葡萄糖苷在0.016～2.550 μg·mL-1响应值与质量浓度之间线性关系良好。

2.2.5精密度试验 精密吸取25.5 μg·mL-1的对照品溶液，重复进样6次，测定峰面积积分值，RSD为0.34%，表明仪器精密度良好。

2.2.6稳定性试验 取同一批益气活血方样品(批号：1607002)，按2.2.2项下方法制备供试品，按2.2.1项下条件，分别于配制后0、2、4、6、8、12 h进样，测定，结果以峰面积计RSD为0.54%，表明该方法12 h内稳定性良好。

2.2.7重复性试验 取同一批益气活血方样品(批号：1607002)6份，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，进样，测定，结果平均质量分数为0.13 mg·g-1，RSD=1.83%(n=6)，表明该方法稳定性良好。

2.2.8加样回收率试验 取已知指标成分含量的益气活血方样品，共6份，精密加入毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，测定，结果见表2。

表2 毛蕊异黄酮葡萄糖苷加样回收率试验结果(n=6)

2.3 出膏率的测定

精密吸取益气活血方水提液样品适量，置干燥的恒重蒸发皿中，水浴蒸干后，放入烘箱中，设定温度为105 ℃，干燥3 h，取出后再于干燥器中冷却20 min，精密称定并按公式(1)计算。

(1)

2.4 单因素试验

影响水煎煮的因素有很多，如饮片大小、浸泡与否等，但主要影响因素还是提取次数、提取时间和加水量。

2.4.1提取次数的考察 按益气活血处方称取饮片共5份，分别加入10倍量的水，浸泡1 h，按提取次数为1、2、3、4、5次煎煮，每次1 h，滤过，浓缩，再加水定容至适量。按2.1～2.3项下方法制备供试品、测定、计算。结果见图3。

图3 益气活血方提取次数与转移率、出膏率关系

由图3可知，煎煮液中黄芪甲苷的转移率在煎煮3次后增加不明显，毛蕊异黄酮葡萄糖苷的转移率在煎煮第1～4次间呈缓慢线性增加，两者的转移率在煎煮4次后均稍有降低；出膏率在煎煮2次后增加不明显。

2.4.2提取时间的考察 按益气活血处方称取饮片5份，分别加入10倍量的水，浸泡1 h，按提取时间为0.5、1、1.5、2、2.5 h，分别提取1次，滤过，浓缩，再加水定容至适量。按2.1～2.3项下方法制备供试品、测定、计算。结果见图4。

图4 益气活血方提取时间与转移率、出膏率关系

由图4可知，煎煮液中黄芪甲苷的转移率在煎煮1.5 h后开始下降；毛蕊异黄酮葡萄糖苷的转移率及出膏率随时间增加变化不明显。

2.4.3加水量的考察 按处方称取饮片5份，按加水量6、8、10、12、14倍分别加水，浸泡1 h，提取1次，每次1 h，滤过，浓缩，再加水定容至适量。按2.1～2.3项下方法分别制备供试品、测定、计算。结果见图5。

图5 益气活血方加水量与转移率、出膏率关系

由图5可知，煎煮液中黄芪甲苷的转移率在加入10倍水的条件下增加明显，加入12、14倍水转移率差别不大；毛蕊异黄酮葡萄糖苷的转移率在加入6、8、10倍水时变化不明显，加入12倍水时稍有增加。出膏率的增加幅度较小。

2.5 正交试验

2.5.1正交试验设计 选择提取时间(A)、提取次数(B)和加水量(C)为考察因素，平行操作条件下，以黄芪甲苷转移率、毛蕊异黄酮葡萄糖苷转移率、出膏率为评价指标，按 L9(34)正交表设计试验。

2.5.2水煎煮工艺因素水平的选择 选用正交试验表L9(34)，见表3。

表3 益气活血方水煎煮工艺因素水平

2.5.3水煎煮正交试验结果 黄芪、炙黄芪为方中君药，所占比例较大，将两者主要有效成分设为主要指标，出膏率为次要指标。设黄芪甲苷转移率权重为0.4，毛蕊异黄酮葡萄糖苷转移率权重为0.4，出膏率权重为0.2，结果见表4～5。

综合得分=黄芪甲苷转移率×0.4+
毛蕊异黄酮葡萄糖苷转移率×0.4+出膏率×0.2

(2)

表4 益气活血方水煎煮工艺正交试验设计及直观分析

表5 益气活血方水煎煮工艺正交方差分析

由表4可知，B对试验结果影响较显著。选择的3个因素对试验结果的影响由大到小顺序为B>C>A，最佳提取工艺条件为 A2B3C3。由表5可知，B影响差异有统计学意义(P<0.05)，A、C对结果影响差异无统计学意义。综合考虑生产的各方面因素，确定加12倍量水，提取3次，每次煎煮1 h为最佳提取工艺。

2.5.4水煎煮工艺验证实验 按益气活血处方称取3份与正交试验相同批次的饮片，按优选的提取工艺参数进行煎煮，结果见表6。

表6 益气活血方水煎煮工艺正交验证实验 %

所得结果与正交试验结果最大值基本接近。可判断，优选的工艺可行、稳定。

2.6 传统煎煮法

2.6.1传统煎煮的方法 称取益气活血处方中各味饮片，平行5份，煎煮2次，第一煎加水500 mL浸泡1 h，武火煮沸后文火煎煮0.5 h，滤过；第二煎药渣加水200 mL煎煮0.5 h，合并滤液备用。

2.6.2试验方法与结果 按2.1～2.3项下方法制备供试品、测定、计算，试验结果见表7。

表7 益气活血方传统煎煮法试验结果 %

2.6.3传统煎煮方法与优选工艺结果比较 将传统煎煮方法与优选工艺结果比较，见图6。

图6 益气活血方传统煎煮法与优选工艺结果比较

由图6可知，优选工艺煎煮液的出膏率及有效成分的转移率均高于传统煎煮方法，进一步验证了优选工艺的可靠性。

3 讨论

黄芪、炙黄芪为方中君药，所占比例较大，且补气升阳作用明显，与本方专于治疗气虚血瘀型冠心病相一致。故选取黄芪、炙黄芪主要成分作为考察指标。

在建立毛蕊异黄酮葡萄糖苷HPLC时，曾参考《中华人民共和国药典》2015年版梯度洗脱方法，流动相A为乙腈，流动相B为0.2%甲酸水溶液，梯度洗脱(0～20 min，20%～40%A；20～30 min，40%A)，发现毛蕊异黄酮葡萄糖苷与其他成分的分离并不理想。后改现用的梯度洗脱方法，可以较好地与其他组分分离。

益气活血方已应用多年，临床上患者使用的是中药汤剂，其携带、贮存及服用不方便，剂量也不十分准确，因此，需进行剂型改进。以汤剂为基础的内服制剂可有合剂、颗粒剂等多种口服剂型选择。合剂保持了汤剂的用药特点，但其携带、贮存不便。颗粒剂不仅具备汤剂相对用药量大、起效迅速的特点，还具有携带、贮存运输方便、稳定性好、服用量准确等诸多优点，也克服了胶囊剂和片剂载药量相对有限、服用量达不到治疗剂量的缺陷，因此，选择了颗粒剂作为益气活血方的剂型。颗粒剂的成型工艺及设备有多种，如湿法制粒、干法制粒、一步制粒法等。一步制粒是目前最常用的工艺方法，便于自动控制，生产环境更加符合《药品生产质量管理规范》要求，并在很大程度上解决了中药浸膏黏性大、成型困难等问题。后续按照优选工艺采用一步制粒法进行了3批中试研究，即加12倍量水，煎煮3次，每次1 h。滤液先减压浓缩(70～75 ℃，-0.04～-0.08 MPa)至相对密度为1.20(60 ℃)左右，趁热将甜菊素加入，备用。一步制粒前，将稠浸膏加纯化水稀释至相对密度为1.15～1.20(20 ℃)。制粒时，先将糊精吸入流化床中，设置进风温度为90～100 ℃，待物料温度达到70～80 ℃时，开始进液。根据实际情况及时调节进样速度(80～150 r·min-1)、雾化压力(1.5～2.0 kg·cm-2)、进风量(800～1800 m3·h-1)。进液结束后，70 ℃干燥约1 h。3批中试产品黄芪甲苷转移率分别为40.49%、40.90%、41.16%，毛蕊异黄酮葡萄糖苷转移率分别为46.36%、41.82%、41.45%。本实验优选的提取工艺，为益气活血颗粒开发为医疗机构制剂提供了参考。

医疗机构中药制剂多选取医院临床应用效果良好的处方研制，疗效确切、使用方便、价格低廉，同时也能体现中医药特色治疗优势。《中华人民共和国中医药法》、2018年国家食品药品监督管理总局发布关于的“对医疗机构应用传统工艺配制中药制剂实施备案管理的公告(2018年第19号)”等相关法规及细则的出台，将给医疗机构中药制剂研制与开发带来更多的激励、机遇和挑战[9-11]。