不同光强处理下拟巫山淫羊藿生物学性状和淫羊藿苷类黄酮的变化△

潘俊倩，李小明，杨倩茹，落艳娇，4，申国安，徐超群，魏升华，郭宝林*

1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193；2.军事医学研究院 辐射医学研究所，北京 100850；3.贵州中医药大学 药学院，贵州 贵阳 550025；4.山西医科大学，山西 太原 030001

淫羊藿为传统中药，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的作用。现代研究表明，淫羊藿含有黄酮类、生物碱、多糖、木脂素等多种化学成分[1]。其中，C8位具有异戊烯基的淫羊藿苷类黄酮具有促进雄性功能、雌激素样作用，抗肝癌、乳腺癌、白血病等和改善心血管系统、骨骼系统等作用；多糖能调节免疫、抗病毒等[2-3]。近年来，随着市场需求不断增加，野生淫羊藿资源不断减少，进行人工栽培是实现资源可持续利用的必由之路。拟巫山淫羊藿EpimediumpseudowushanenseB.L.Guo是2007年发表的淫羊藿属新物种[4]，分布于贵州贵阳、黔南和黔东南地区及广西东北部地区等。该物种中朝藿定C含量远远高于药用种类巫山淫羊藿，是淫羊藿属首个实现了人工栽培的物种。

野生拟巫山淫羊藿主要生长于灌丛下、林缘等环境中，是一种典型的阴生植物，对光的反应非常敏感。种植过程中，一般用70%～90%的遮荫网，或者种植在相似遮荫度的林下。本课题组Pan等[5]研究了不同光强处理60 d后拟巫山淫羊藿中淫羊藿苷类黄酮成分差异，发现(18.2±2.5) μmol·m-2·s-1下，拟巫山淫羊藿的生长发育状态较好，而(54.6±2.5) μmol·m-2·s-1下淫羊藿苷类黄酮积累较多，生物量较大。本研究在以上2种光强下，测定拟巫山淫羊藿植物在萌芽30、60、90、120 d持续生长过程中的各项生长发育指标(株高、复叶面积、分枝数、含水量、叶绿素含量、叶片生物量)以及淫羊藿苷类4种主要黄酮成分(淫羊藿苷、朝藿定C、朝藿定A、朝藿定B)的变化规律，进一步阐明2种光强处理下拟巫山淫羊藿生长发育和黄酮成分积累特点，为淫羊藿的种植和采收提供参考。

1 材料

朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷对照品(实验室自制，HPLC纯度>98%)；乙腈(色谱纯，Honeywell International Inc.)；甲醇、乙醇均为分析纯，购自北京化工厂；水为娃哈哈纯净水。

LI-3000C型叶面积仪(LI-COR，American Lincoln Industries Co.，Ltd.)；SPAD-502型叶绿素仪(Konica Minolta Inc.)；高效液相色谱仪(Perkin Elmer Instruments Co.，Ltd.)；KQ-250DB型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；AL204-IC型电子分析天平(Mettler Toledo International Trading Co.，Ltd.)；XSl05型电子天平(Mettler Toledo International Trading Co.，Ltd.)。

选取贵州雷山淫羊藿种植基地的1年生健康实生苗，经中国医学科学院药用植物研究所郭宝林研究员鉴定为拟巫山淫羊藿EpimediumpseudowushanenseB.L.Guo。

2 方法

2.1 生长指标测定

将淫羊藿实生苗移入中国医学科学院药用植物研究所温室中，花盆基质为泥炭土和蛭石(3∶1)混合。2014年2月1日(新叶萌发前)，选择长势一致的植株移入培养间(温度：20～21 ℃，相对湿度：60%，光照时间：16 h·d-1)，分别在光强(18.2±2.5) μmol·m-2·s-1(L1)和(54.6±2.5) μmol·m-2·s-1(L2)下持续培养一段时间。每个光强下处理36株，在30、60、90、120 d分别取9株测定相关指标。

株高采用卷尺测量茎基到最顶部叶片的高度；复叶面积采用叶面积仪测量一回三出复叶中3片小叶的面积；分枝数为根状茎上萌发的分枝数；叶片总生物量采用天平测量植物所有新鲜叶片的质量(鲜质量)，然后于60 ℃烘箱中干燥叶片至质量恒定后测量干燥叶片的质量(干质量)；比叶面积(SLA)为复叶面积与复叶干质量的比值；水分含量采用公式(1)计算；叶绿素含量(SPAD值)采用叶绿素仪在650、940 nm波长下测定叶片的叶绿素含量；淫羊藿苷类成分含量采用参考文献[5]方法，每个植株每个时期取1个小叶片合并为1个样品，测定叶片中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C及淫羊藿苷4种淫羊藿苷类黄酮成分含量。

水分含量=1-叶片干质量/叶片鲜质量×100%

(1)

2.2 分析方法

采用SPSS v20软件对数据进行t检验和重复测量的方差分析，用Tukey HSD测试来比较不同方法之间的差异。其中，t检验、方差分析和Tukey HSD测试的P值分别设置为0.05。

3 结果与分析

3.1 光强对拟巫山淫羊藿生长发育的影响

3.1.1株高 从图1看出，2种光强下，30 d均是拟巫山淫羊藿植株的快速增高生长时期。60 d内还有少量生长，和30 d比较差异有统计学意义(P<0.05，下同)；60 d后，L1光强下到90 d略有生长，120 d时不再增高，而L2光强下90 d时已基本没有生长，2种光强处理90、120 d与60 d差异无统计学意义，表明强光下株高更早达到峰值，停止生长。

注：不同大写字母表示同一光强下不同处理时间之间的差异性(P<0.05)；不同小写字母表示同一处理时间下不同光强之间的差异性(P<0.05)；下同。图1 2种光强持续处理下拟巫山淫羊藿株高的动态变化

3.1.2复叶面积 从图2看出，2种光强下，拟巫山淫羊藿植株叶片的生长趋势相同。30 d内叶片大小已经基本达到最大，60、90、120 d与30 d相比差异无统计学意义。

图2 2种光强持续处理下拟巫山淫羊藿复叶面积的动态变化

3.1.3比叶面积 从图3看出，2种光强下，30～90 d拟巫山淫羊藿的比叶面积持续减小(且各时期差异均有统计学意义)，其中L1光强下的变化幅度大，90 d后，L1光强下略降低，L2光强下略升高。在30～90 d期间叶面积没有变化，含水量变化降低幅度较小的情况下，表明有叶片厚度增加或生物量积累的变化。

图3 2种光强持续处理下拟巫山淫羊藿比叶面积的动态变化

3.1.4分枝数 从图4看出，2种光强下拟巫山淫羊藿的分枝数增加的节律不同，L1光强下60 d达到最大分枝数，其后已基本没有增加，90、120 d与60 d差异无统计学意义；而L2光强下分枝数增加到90 d。表明强光有持续促进新分枝形成的作用。

图4 2种光强持续处理下拟巫山淫羊藿分枝数的动态变化

3.1.5含水量 从图5看出，2种光强下，拟巫山淫羊藿叶片的含水量在整个处理时期呈现降低趋势。L1光强下表现出持续降低(各时期差异均有统计学意义)，而L2光强下降低幅度较小，其中在60～90 d差异无统计学意义。表明强光下，叶片的含水量降低达到最终状态的时间较早。

图5 2种光强持续处理下拟巫山淫羊藿叶片含水量的动态变化

3.1.6叶绿素含量 从拟巫山淫羊藿的叶片生长来说，30 d完成展叶，但要达到60 d才完全成熟，所以表现出30 d的SPAD较高。从图6看出，L1光强下，叶片的SPAD在30 d时最高，60 d降低，然后变化不明显；L2光强下，则30 d和60 d差异无统计学意义，其后持续降低。

图6 2种光强持续处理下拟巫山淫羊藿叶片叶绿素含量的动态变化

3.1.7单株叶片生物量 从图7看出，L1光强下，单株叶片生物量(干质量)在缓慢增加，而L2光强下，90 d之前在增加，且增加幅度大于L1光强，90～120 d则略有降低。单株叶片生物量来自植株的单叶片生物量和叶片数量，拟巫山淫羊藿的叶为根状茎萌发出的基生叶，叶片数量和萌发分枝数直接相关，可看到L1光强下，分枝数在60 d后变化不大，而比叶面积和含水量在降低，因此单株叶片生物量的升高主要来自于干物质积累导致的单叶质量增加，而L2光强下，分枝数在90 d之前增加量较大，而比叶面积和含水量变化较小，因此单株叶片生物量的增加主要来自于分枝数的增加。

图7 2种光强持续处理下拟巫山淫羊藿叶片生物量的动态变化

3.2 光强对拟巫山淫羊藿苷类黄酮成分含量的影响

2种光强下，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷4种成分总量参见表1。拟巫山淫羊藿中朝藿定C占4种成分总量的80%以上，而另外3个成分含量较少，因此总成分含量和朝藿定C的含量表现基本一致。

朝藿定A、朝藿定B和淫羊藿苷在L1光强下，大致表现为成分持续降低，可能与干物质积累增加相关；而L2光强下，均表现为先降低，后升高，再降低的趋势，由于此3个化合物属于含量较低的成分，影响因素较为复杂，需要进一步研究。

表1 2种光强不同处理时间下拟巫山淫羊藿的4种黄酮成分质量分数及总量 %

4 结论

光强影响植物的多种生长特性，如高度、叶面积、比叶面积、分枝数、总生物量等[6]。拟巫山淫羊藿是阴生药用植物，前期比较了5种光强对淫羊藿生长发育的影响[5]，发现随光强增加，分枝数、复叶面积、SPAD值、含水量在(54.6±2.5) μmol·m-2·s-1光强之后差异无统计学意义，而主要成分朝藿定C含量达到最高。其中，(18.2±2.5) μmol·m-2·s-1光强下，复叶面积、SPAD值最大；而(54.6±2.5) μmol·m-2·s-1光强下，含水量最低，朝藿定C及总黄酮含量最高，分枝数达到饱和状态。

本研究进一步研究2种光强下各个指标的持续变化，发现两者的变化规律不太一致。2种光强作用下的拟巫山淫羊藿株高均为生长到60 d基本不增加，叶面积的生长期为0～30 d。比叶面积随发育时间而持续降低，90 d后变化较小。分枝数随着植物生长，芽从地下根状茎上萌发而增加。L1光强下，只在30～60 d的时候有所增加，属于淫羊藿生长发育的一般节律，即早春较短的萌发时间段，但是L2光强下分枝数增加幅度较大，且持续到90 d。经观察，强光可以刺激的根状茎上的休眠芽继续萌发，形成新的地上分枝。有报道，香石竹品种“媚娘”的侧芽数在全光照下一直显著增多，在一层60%透光遮阳网下2008年5月4日前显著增加，在二层60%透光遮阳网下2008年4月24日之前显著增加，表现出强光促进侧芽数的萌发[7]。叶片的含水量在L1光强下，表现为持续降低，而在L2光强下，60 d基本上达到最终状态，后续变化很小了。

因此，本研究结果支持课题组的前期研究，L1光强下植物表现为正常的生长发育状态，而强度为L1的3倍的L2光强，具有刺激拟巫山淫羊藿根状茎芽萌发作用，也促进叶片的提前成熟；在叶片总产量上，90 d与60 d相比，强光下较弱光下更高。拟巫山淫羊藿的叶绿素含量结果表明，在L2光强下，叶绿素含量持续减少。

淫羊藿苷类成分的含量变化，在不同光照强度下表现不同。弱光下，呈现稳中有升的趋势；而强光下，则在30 d为最高，随后均有显著下降。因此如果选择较强的光照来获得较高的拟巫山淫羊藿产量和含量，应在强光处理后及时采收，避免长时间带来的成分减少。