基于SNP双峰法的人参花 西洋参花 三七花及其混合物的快速鉴定△

曹佩，王刚，白璇姣，韩建萍

中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所 国家中医药管理局中药资源保护重点研究室，北京 100193

人参花、西洋参花和三七花分别来自于人参PanaxginsengC.A.Mey.、西洋参P.quinquefoliusL.和三七P.notoginseng(Burk.)F.H.Chen，近年来逐渐被作为“花茶”应用于日常保健。现代药理学研究表明，人参花的主要有效成分为多糖和人参皂苷[1-2]，可以有效地提高人体免疫力、清除自由基，具有重要的应用价值[3]。西洋参花多糖可以调节巨噬细胞活性，是保健品和食品理想的原材料[4]。三七花中含有大量皂苷类、总酚类和黄酮类化合物及矿物质，可以抑制人体内自由基的生成，也逐渐被作为营养添加剂应用于食品和药品中[5]。但是三者均以总花梗短、小花团聚为特征，外观可分辨度低，在干燥之后作为花茶更加难以辨认。此外，化学成分的相似性也从一定层面上增加了其鉴定难度。孟祥松等[6]采用高效液相色谱法(HPLC)对人参花、西洋参花和三七花鉴别时发现，人参花中独有人参皂苷Rg1峰，三七花中独有人参皂苷Rb1峰，除此之外，在化学成分上无明显差异。当出现人参花与西洋参花、西洋参花与三七花混杂时，化学方法难以鉴定真伪。因此，运用传统鉴别方法对这3种花蕾进行准确鉴别难度极大。

DNA条形码分子鉴定方法是基于分子生物学和生物信息学，结合不同物种基因组中一段公认且相对较短的DNA序列的高效物种鉴定方法，已成功应用于植物、动物和部分深加工产品的鉴定中[7-9]。对于植物而言，DNA条形码分子鉴定体系主要包括核心鉴定序列内转录间隔区2(ITS2)和辅助鉴定序列psbA-trnH[10]。ITS2序列具有扩增效率高、种内较为保守、种间变异大等优点[11]，已成功应用于众多药用植物的鉴定中。研究发现，ITS2条形码聚合酶链式反应(PCR)扩增成功率(93.8%)高于psbA-trnH(92.8%)和ITS(42.3%)，且在4800余种、6600多份的植物样本中，ITS2(92.7%)条形码的鉴定效率高于psbA-trnH(67.6%)。在ITS2条形码的基础上，利用单核苷酸多态性(SNP)位点可实现近缘物种间的鉴别[11]。根据本课题组前期研究结果，利用人参和西洋参的SNP位点可以准确鉴定出人参和西洋参。当人参和西洋参以1∶19混合时，在SNP处可出现双峰，且峰高[西洋参的主峰鸟嘌呤(G)/腺嘌呤(A)高于人参的主峰A/G)]可大致反映掺杂比例[12]。

本研究收集市售人参花6份、西洋参花9份和三七花7份，基于ITS2序列对其进行鉴定，并建立了快速鉴别两两混合物的SNP双峰法，以期为市场上人参花、西洋参花和三七花的质量控制提供参考。

1 材料

1.1 试药

人参花、西洋参花和三七花样品购买于不同药材市场及道地产区，共计22份。其中，人参花 6份、西洋参花9份、三七花样品7份(表1和图1)。由中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所林余霖研究员对人参花、西洋参花和三七花进行形态学鉴定，分别为人参PanaxginsengC.A.Mey.、西洋参P.quinquefoliusL.和三七P.notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥花蕾。

DP316植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)；2×Taq聚合酶链式反应(PCR) Master Mix(北京艾德莱生物科技有限公司)；引物由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成。

1.2 仪器

MM400型冷冻混合球磨仪(德国Retsch公司)；LUX-24型数显恒温水浴锅(北京陆希科技有限公司)；846-x-070-301型PCR仪(德国Biometra公司)；移液器(德国Eppendorf公司)；D-37250型冷冻离心机(德国Sigma公司)；GelDoc XR+IMAGELAB型凝胶成像仪(德国Bio-Rad公司)。

表1 西洋参花、三七花、人参花样品信息

注：A.人参花；B.西洋参花；C.三七花；图2同。图1 人参花、西洋参花和三七花

2 方法

2.1 DNA提取

取人参花、西洋参花和三七花样品20 mg；对于混合样品，将已鉴定为正品的人参花、西洋参花和三七花打粉，过二号筛，以2∶8、2∶10、8∶2和10∶2两两均匀混合，取混合后的植物粉末20 mg。采用球磨仪研磨2 min(30 Hz)。使用植物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA。研磨后的样品加入裂解液后，将其置于65 ℃水浴2 h，用-20 ℃异丙醇沉淀DNA，其余步骤参照试剂盒说明书进行[13]。

2.2 PCR扩增

ITS2引物为2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′；3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。将引物稀释至2 μmol·μL-1，扩增DNA模板。PCR体系为DNA模板2 μL、2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL、引物2F/3R(2.5 μmol·L-1)各1.0 μL、ddH2O 8.5 μL，共25 μL。反应程序为94 ℃，30 s；56 ℃，30 s；72 ℃，45 s，40个循环；72 ℃孵育10 min，纯化后的PCR产物送至中国农业科学院重大工程实验室进行测序。

2.3 数据分析

利用CodonCode Aligner V 9.0.1(CodonCode Co.)软件进行序列校对、拼接，去除低质量序列及引物区。基于隐马尔可夫模型(Hidden Markov model，HMM)去除5.8 S rRNA和28 S rRNA基因区。使用“中药材DNA条形码鉴定系统”(www.tcmbarcode.cn)和美国国家生物技术信息中心(NCBI)的BLAST(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)功能完成人参花、西洋参花和三七花的物种鉴定。采用MEGA 7.0软件对测序得到的ITS2序列和GenBank下载的人参属ITS2序列进行多序列比对。

3 结果

3.1 人参花、西洋参花和ITS2 2F/3R三七花SNP位点的筛选

所有样品均采用ITS2 2F/3R引物进行扩增，扩增成功率为100%，ITS2序列大小为230 bp，具体信息见图2，共获得了22条ITS2序列。BLAST结果表明，所有市售样品均为正品。采用MEGA 7.0将获得的序列进行比对，比对结果表明，在19～47 bp处，存在人参花、西洋参花和三七花的稳定遗传变异。在该区间内，人参特有的序列片段为5′-AACCCATCACTCCCTTGCGGGAGTTGAGG-3′，与人参相比，西洋参呈现2个变异位点[分别是32位胸腺嘧啶(T)和43位胞嘧啶(C)]，三七出现4个变异位点(分别是28位T、34位C、43位C和46位T)，见表2。

图2 人参花、西洋参花和三七花的ITS2序列特征

表2 人参花、西洋参花和三七花ITS2区域5个稳定的SNP位点

3.2 人参花、西洋参花和三七花ITS2数据库的建立及SNP位点保守性评估

为了评价该区间在物种鉴定方面的准确性和特异性，从GenBank下载了109条人参、西洋参和三七的ITS2序列，并采用MEGA 7.0进行比对(图3)。比对结果表明，在这28 bp内，3个物种间存在稳定的变异位点。其中，人参和西洋参存在2个变异位点，人参和三七存在4个变异位点，西洋参和三七存在4个变异位点。因此，在19～47 bp内的SNP位点可应用于人参花、西洋参花和三七花的物种鉴定。

3.3 基于SNP双峰法的混合物检测

将人参花和西洋参花、人参花和三七花、西洋参花和三七花粉末以2∶8、2∶10、8∶2和10∶2人工混合，混合物的DNA均采用ITS2 2F/3R引物进行扩增，扩增成功率为100%。以PCR产物的测序峰图对混合粉末的物种组成进行了检测。

如图4所示，人参的SNP位点(32、43 bp)处主峰为C/T(图4A)，西洋参在该处的主峰为T/C(图4B)，混合物仅在SNP位点出现双峰(图4C～F)。当人参花和西洋参花以2∶8混合时，BLAST分析显示该样品为人参。此时，在32 bp处，西洋参花的主峰T略高于人参花的主峰C，在43 bp处，人参花的主峰T略高于西洋参花的主峰C(图4C)，表明该样品为人参花和西洋参花的混合物。当人参花和西洋参花以2∶10混合时，BLAST分析显示该样品为西洋参。此时，西洋参花的主峰T/C高于人参花的主峰C/T(图4D)，表明该样品为掺杂有人参花的西洋参花。当人参花和西洋参花以8∶2混合时，BLAST分析显示该样品为人参。此时，人参花的主峰C/T高于西洋参花的主峰C/T(图4E)，表明该样品为掺杂有少量西洋参花的人参花。当人参花和西洋参花以10∶2混合时，BLAST结果显示该样品为人参。此时，人参花的主峰C/T远高于西洋参花的峰T/C(图4F)，表明该样品为掺杂有微量西洋参花的人参花。

图3 人参、西洋参和三七的ITS2序列片段比对结果

注：A.人参花；B.西洋参花；C.人参花和西洋参花2∶8混合；D.人参花和西洋参花2∶10混合；E.人参花和西洋参花8∶2混合；F.人参花和西洋参花10∶2混合。图4 人参花、西洋参花和两花混合物双峰图

如图5所示，人参的SNP位点(28、34、43、46 bp)处主峰为C/T/T/G(图5A)，三七在该处的主峰为T/C/C/T(图5B)，混合物仅在SNP位点处出现双峰(图5C～F)。当人参花和三七花以2∶8混合时，BLAST分析显示该样品为三七。此时，在28、34、46 bp处，三七花的主峰T/C/T略高于人参花的主峰C/T/G，在43 bp处，人参花的主峰略高于三七花的主峰C(图5C)，表明该样品为掺杂有人参花的三七花。当人参花和三七花以2∶10混合时，BLAST分析显示该样品为三七。此时，在28、34、46 bp处，三七花的主峰T/C/T高于人参花的主峰C/T/G，在43 bp处，人参花的主峰高于三七花的主峰C(图5D)，表明该样品为掺杂有少量人参花的三七花。当人参花和三七花以8∶2混合时，BLAST分析显示该样品为人参。此时，人参花的主峰C/T/T/G高于三七花的主峰T/C/C/T(图5E)，表明该样品为掺杂有少量三七花的人参花。当人参花和三七花以10∶2混合时，BLAST分析显示该样品为人参。此时，人参花的主峰C/T/T/G远高于三七的主峰T/C/C/T(图5F)，表明该样品为掺杂有微量三七花的人参花。

注：A.人参花；B.三七花；C.人参花和三七花2∶8混合；D.人参花和三七花2∶10混合；E.人参花和三七花8∶2混合；F.人参花和三七花10∶2混合。图5 人参花、三七花和两花混合物双峰图

如图6所示，西洋参花在28、32、34、46 bp处主峰为C/T/T/G(图6A)，三七花在该处的主峰为T/C/C/T(图6B)，混合物仅在SNP位点处出现双峰(图6C～F)。当西洋参花和三七花以2∶8混合时，BLAST分析显示该样品为三七，此时，三七花主峰T/C/C/T高于西洋参花的主峰C/T/C/G(图6C)，表明该样品为掺杂有少量西洋参花的三七花。当西洋参花和三七花以2∶10混合时，BLAST分析显示该样品为三七。此时，在34 bp处，三七花主峰C远高于西洋参花的主峰T(图6D)，表明该样品为掺杂有微量西洋参花的三七花。当西洋参花和三七花以8∶2混合时，BLAST分析显示该样品为西洋参。此时，在28、34、46 bp处，西洋参花的主峰C/T/G高于三七花的主峰/T/C/T，在32 bp处，三七花的主峰C高于西洋参花的主峰T(图6E)，表明该样品为掺杂有三七花的西洋参花。当西洋参花和三七花以10∶2混合时，BLAST分析显示该样品为西洋参。此时，西洋参花的主峰C/T/T/G远高于三七花的主峰/T/C/C/T(图6F)，表明该样品为掺杂有少量三七花的西洋参花。

注：A.西洋参花；B.三七花；C.西洋参花和三七花2∶8混合；D.西洋参花和三七花2∶10混合；E.西洋参花和三七花8∶2混合；F.西洋参花和三七花10∶2混合。图6 人参花、三七花和两花混合物双峰图

3.4 基于SNP双峰法对市售商品BLAST结果的深度验证

鉴于混合物的BLAST分析结果与实际结果存在差异，对采用BLAST分析的22份花类商品进行了深度分析。峰图显示(图7)，样品S1和样品S7在32、43 bp处出现双峰，且T/C峰高于C/T峰，表明样品1和样品7为掺杂有少量人参花的西洋参花。此外，其余20份样品在SNP处均为单峰，表明均为正品。

注：S6.正品西洋参花；S1、S7.掺杂有少量人参花的西洋参花。图7 西洋参花样品双峰图

4 讨论

4.1 SNP双峰法在花类混合物鉴定中的必要性

人参花、西洋参花和三七花不仅可以作为花茶饮用，同时也是很多保健品的原材料。但是，由于此3类物种的相似性和市场监管的缺失，有必要开发一种新的鉴别方法对该类产品市场进行规范化的引导。

Chen等[12]发现，人参和西洋参的遗传距离较小(0～0.02)，在其ITS2区域可以检测出稳定的SNP位点，认为ITS2可应用于人参和西洋参的鉴别。Liu等[14]报道了一种基于ITS2序列的西洋参专属分子身份证，应用该分子身份证不仅可实现西洋参与其混伪品的鉴别，还可实现深加工的中成药鉴别。但是，目前对于该类产品多集中于混伪品的研究，缺乏对于混合物行之有效的鉴定方法。基于以上条形码鉴定方法在物种鉴定上的准确性，考虑将该方法引入到花类产品以及花类混合物的鉴定中。本研究中发现了可应用于人参花、西洋参花和三七花物种鉴定的SNP位点，不仅可以准确鉴定这3种花的真伪，还可以对混合粉末的组成做出判断。

4.2 SNP双峰法是BLAST分析的补充手段

在本研究中，SNP双峰法可准确、迅速、直观地对近缘物种进行鉴定。通过人工混合不同比例的人参花和西洋参花、人参花和三七花、西洋参花和三七花来验证该方法的准确性。通过对混合物ITS2序列的BLAST分析法和SNP双峰法的分析结果进行对比，发现SNP双峰法是物种鉴定的灵敏手段。当西洋参花和三七花以2∶8混合时，BLAST结果显示该样品为三七，此时，三七花主峰T/C/C/T高于西洋参花的主峰C/T/C/G，表明该样品为掺杂有西洋参花的三七花。Gao等[15]发现，即使在混合比例低至6%时，通过分析SNP位点的双峰仍可以清楚地检测到金银花和山银花的混合物。同样，在本研究中，通过分析SNP位点的双峰，可以有效地鉴定人参花和西洋参花、人参花和三七花、西洋参花和三七花的混合物。

在此基础上，对本研究中的22份商品花类进行了深度鉴定。鉴定结果表明，22份商品中，20份商品为正品。BLAST分析结果表明，基于DNA条形码序列判断22份商品均为正品。而SNP双峰法的验证结果显示，所有的人参花和三七花均为正品，但9份西洋参花中有2份商品在SNP位点处出现双峰，且西洋参花的主峰T/C高于人参花的主峰C/T，据此推断这2份样品为掺杂有少量人参花的西洋参花。因此，SNP双峰法可以作为BLAST分析的补充手段，用于物种的鉴定。

4.3 SNP双峰法为花类市场监管提供有效的技术支撑

近年来，DNA条形码技术已经广泛应用于中药的物种鉴定(包括根类、种子类、叶类和花)[16-19]。这些结果表明，DNA条形码是高效的物种鉴定工具。本研究在DNA条形码的基础上，成功利用SNP双峰法对市售人参花、西洋参花和三七花进行了鉴定，且实现了3种花类两两混合物的鉴定。因此，利用SNP双峰法可实现人参花、西洋参花和三七花的鉴定，同时可为花类产品的检测提供参考。