粪便性状及分析前标本处理方式对钙卫蛋白检测结果影响探讨

曾俊祥，高莉梅，余悠悠，潘秀军

(上海交通大学医学院附属新华医院检验科，上海 200092)

粪便钙卫蛋白(fecal calprotectin, FC)是一项较为理想的评估肠道黏膜炎症的非侵袭性标志物，目前被广泛用于炎症性肠病患者的鉴别诊断、病情评估及疗效监测等方面，从某种角度而言，FC的结果是临床治疗决策的重要条件，FC结果的误差往往会延误炎症性肠病患者尤其是患儿的治疗[1]。但由于粪便成分复杂，FC在检测过程中有较多影响实验结果的因素，特别是分析前阶段[2]，被认为是分析误差的主要来源，但国内对此认识极少。因此，本研究试分析萃取方式、离心条件对不同性状粪便的FC测定结果的影响，以期进一步优化检测流程，为规范粪便FC检测实验操作提供依据。

1 材料和方法

1.1标本来源 收取2020年4月至2020年6月期间在上海交通大学医学院附属新华医院进行粪便FC项目检测后的剩余标本370例，排除由于量过少不适合进行多次提取的标本后，最后得到357例，置于-20 ℃冻存。

1.2试剂与仪器 粪便钙卫蛋白检测试剂盒及配套采样管(ELISA法，瑞士BÜHLMANN公司)、粪便标本采样保存管(厦门为正生物公司)；Multiskan Ascent酶联仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)，VORTEX旋涡混合仪(江苏康健医疗用品公司)，Multiskan Ascent 酶联仪(美国 Thermo Fisher Scientific 公司) 。

1.3样本处理

1.3.1样本性状评估 按照布里斯托大便分类量表(Bristol stool scale，BSS)，将标本性状分为水样(BSS=7)、胶冻(BSS=5、6)、软糊(BSS=3、4)、坚硬(BSS=1、2)。

1.3.2样本采样 采样前，所有标本在室温下保存4 h复温。选取4类不同性状的大便标本各3例，分别进行称量法和采样器采样法采样。(1)称量法采样：由于坚硬便标本难以均质化，在标本不同位置采用多点采样法，而其他性状标本使用一次性搅拌棒进行彻底匀浆，采样后置于清洁试管中，应用Metler AG-160分析天平称量每支试管采样前后的重量，依次标号并记录。(2)采样管采样：分别用检测试剂盒配套采样管(采样管A)、粪便标本采样保存管(采样管B)采样。

1.3.3抽提及萃取 (1)称量法萃取：按照检测试剂说明书，以每毫克标本加入50 mL萃取液的比例，根据各标本质量，依次加入对应体积萃取液进行萃取。(2)采样管法萃取：严格按照萃取管操作说明书进行。

1.3.4混匀与溶解 所有样本在加入萃取液后，在VORTEX旋涡混合仪上涡旋震荡15 min，使其充分溶解混匀后备用。

1.4FC检测 按照试剂盒说明书进行操作，采用ELISA法进行FC检测。

1.5研究方法

1.5.1采样方式对粪便FC检测结果影响 随机选取4类不同性状的粪便标本各10例，同时用称量法和采样器采样法分别进行采样、萃取，混匀溶解完毕后同时采用ELISA法进行检测。以称量法结果作为标准，分别计算采样管A、B的结果偏移度，公式：平均偏移度=(采样管A/B结果-称量法结果)/称量法结果×100%。

1.5.2离心条件对粪便FC检测结果影响 所有样本进行性状评估后，随机抽取10例标本(每种形状样本至少1例)，每例平均分为4份，采用称重法进行采样、萃取，在检测前分别以2 000 r/min离心5 min、3 000 r/min离心5 min、4 000 r/min离心5 min、3 000 r/min离心10 min这4种条件进行离心，检测离心前、后结果。

1.5.3离心对不同性状粪便FC检测结果的影响 每种性状的标本随机选取各10例，按照上一步离心条件结果进行离心操作，计算不同性状标本离心后结果偏移度，公式：(离心后结果-离心前结果)/离心前结果×100%。

1.5.4离心对高、中、低值区间粪便FC检测结果的影响 标本分别按照不离心和离心进行操作，检测FC结果。对结果进行回顾性分析，按照离心前(不离心)结果分为高值区段(>800 μg/g)、中值区段(200～800 μg/g)、低值区段(<200 μg/g)，计算不同值区间段标本离心后结果偏移度，公式：(离心后结果-离心前结果)/离心前结果×100%。

2 结果

2.1采样方式对粪便FC检测结果影响 随机选取4类不同性状的大便标本共12例，同时使用2种商用化采样器及人工称重法采样，并将按2种采样方式后检测的FC结果进行了比较。装置A所得结果较称量法所得结果平均偏移度为27.2%，装置B达到57.5%。采样装置对于水样便和坚硬便的提取效果较称重法结果差距较大。见图1。

2.2离心条件对粪便FC检测结果影响 抽取10例标本，每例平均分为4份，以不同离心条件进行离心，各离心条件下离心后FC结果、未离心结果比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。而离心的转速(2 000 r/minvs. 3 000 r/minvs. 4 000 r/min)之间、离心时间(3 000 r/min 5 minvs. 3 000 r/min 10 min)之间结果差异无统计学意义(P>0.05)，故选择2 000 r/min离心5 min作为最终离心条件。

表1 离心条件对钙卫蛋白检测结果的影响

2.3离心对不同性状粪便FC检测结果的影响 随机选取每种性状标本各10例，离心前后FC浓度的结果及人工称重法提取的结果见表2。水样、糊状、胶冻、坚硬4种不同性状粪便离心后FC结果平均偏移度为-0.6%、-24.1%、-30.3%、-37%。离心前、后水样便FC结果差异无统计学意义(P>0.05)，而其他性状的粪便结果差异有统计学意义(P<0.05)。除水样便，其他3种性状标本采样管法采集时离心前的结果与称量法结果差异有统计学意义(P<0.05)，离心后的结果与称重法结果差异无统计学意义(P>0.05)，表明离心后的结果更加接近称重法的结果。

表2 不同性状粪便钙卫蛋白离心前后检测结果影响

2.4离心对高、中、低值区间粪便FC检测结果的影响 对常规检测结果回顾性分析，按照结果分为3个区间段，各区段离心前、后结果见表3。离心后中值和高值区段较离心前FC结果出现下降，而低值区段结果差异无统计学意义(P<0.05)。

表3 离心前后对低、中、高值区段粪便钙卫蛋白检测结果影响

3 讨论

称重法采样是FC检测标准的采样方法，但该操作步骤复杂，费时费力，目前大多采用商品化采样管对粪便进行萃取，但采样管本身没有标准，因此厂家根据实际情况各自设计或交付代工厂生产，各类采样管的内部构造、精密度不尽一致[3-4]。FC的检测方法最早是Røseth等[5]报道的，2000年在此基础上Tøn等[6]进行了方法改进，后续不断改良。现今较为认可的检测流程为样本匀浆、称量法采样、等比萃取、离心、样本孵育、样本测定。而商品化试剂盒最大的不同主要在于简化分析前操作流程，除了替换掉称量法，还省去离心步骤，尽管此举便于临床推广，但如此也会带来分析误差。

采样管基本原理是使用固定的容积，以等同于固定的粪便重量。这是基于所有粪便具有同样的密度，而不同性状的粪便显然密度不一，使用均一的采样管，势必无法确保采样的准确性。本研究比较了不同采样管采样的FC结果，发现2种采样管与称量法结果均存在一定偏移。值得注意的是，采样装置对于水样便和坚硬便的提取效果较称重法结果差距较大，考虑的原因主要是萃取装置的采样棒对稀便黏附性差，因此采样量不足；而坚硬便的密度过大，同时采样棒容易黏附多余的粪便进入萃取体系，导致采样量偏多。

本研究发现离心后较离心前的FC结果有所降低，分析其原因可能是粪便中某些有形成分如胆原等造成非特异性吸附，影响检测结果，离心后取上清液可减少这类残留物，同时我们的结果提示离心后FC结果与称量法更为接近，进一步佐证并强调离心这个步骤的重要性。但改变离心条件前后FC结果差异并无统计学意义，因此，建议粪便在用采样装置采样后均应进行离心操作。

本研究为横断面研究，无法前瞻性地按照标准入组病例，而实际上患者的年龄、饮食、服药情况等诸多因素均会影响实验检测结果，我们在之前也有过相关报道[7-8]，后续我们会继续关注检测结果的解读及分析后研究。

本研究结果表明，按照现有商品化采样管的方法，对硬度较大及液态的粪便采样具有较大误差。对此我们建议，对于液态稀便不宜使用采样管，而应使用定量移液管，坚硬粪便应先用锉刀进行样本均质操作后再进行采样操作。尽管国外Roche®、Immunodiagnostik AG®等采样装置宣称更精准稳定，但迫于成本等因素制约，在国内常规应用难度极大。因此，我们呼吁有必要对国内商品化采样装置的制作工艺、样本性状针对性等细节方面进行进一步改良。同时，对于采样好的标本，均应进行离心操作以降低非特异性反应导致的结果偏差。应做好分析前处理，以确保FC结果的可靠性，让其更具有临床参考价值。