转基因玉米TC1507质粒DNA标准物质的研制

瞿 展，杨立桃

(上海交通大学 生命科学技术学院，上海 200240)

随着转基因技术应用的迅速发展，转基因作物的种类和数量快速增长，越来越多的转基因作物已被批准在全球范围内种植。至2018年为止，全球共有26个国家种植转基因作物，种植面积达到1.917亿hm2，包括玉米、大豆、棉花、油菜、紫花苜蓿、甜菜、番木瓜、南瓜和马铃薯等作物[1]。但是转基因作物的安全性一直备受争议，全球大部分国家要求对转基因作物及其产品进行标识管理[2]。例如，欧盟规定转基因含量超过0.9%的食品和饲料需要进行标识，我国为零阈值标识[3-4]。为了能够有效地实施标识管理的法律法规，转基因检测方法和标准物质至关重要[5]。

转基因标准物质是指在转基因检测中用以校准测量装置，评价测量方法或给待检样品赋值的一类物质[6]。在转基因生物检测领域，标准物质用于建立检测方法、校准设备和方法验证。有证标准物质用于控制实验过程和方法，以保证分析测试数据的准确性、可靠性、可重复性和可比性[7]。质粒DNA标准物质作为一种新型的标准物质，在研制方面优点非常突出，如可以通过微生物大量培养、DNA易于提取和纯化、纯度高。而且，同一个质粒分子可以同时包含多个外源目的基因，用于多个转基因元件的检测，经济高效。

转基因玉米TC1507转化体是抗虫耐除草剂的转基因玉米，由陶氏益农公司(DOW AgroSciences LLC，Mycogen)和先锋国际基因公司(Pioneer Hi-Bred International Inc.)联合研制，在我国已经批准进口用作加工原材料。因此，为了保证我国转基因产品标识制度的顺利实施，研制转基因玉米TC1507质粒DNA标准物质，对于转基因玉米检测和监测十分必要。

1 材料与方法

1.1 材料

转基因玉米TC1507及其对应转化受体非转基因玉米由农业农村部科技发展中心提供。

植物基因组DNA提取纯化试剂盒DNeasy Plant Mini Kit购自QIAGEN公司；HR qPCR Master Mix购自上海辉瑞生物技术有限公司；PCR引物和探针均由上海Invitrogen公司合成。

1.2 质粒标准分子的构建

根据转基因玉米TC1507转化体外源插入序列与玉米基因组邻接区序列信息(http://gmdd.sjtu.edu.cn)，分别设计特异性扩增引物，同时在引物中加入适宜的酶切位点以实现质粒分子的克隆。扩增后将片段分别克隆到前期构建完成的玉米基础框架载体中。

1.3 定量PCR反应体系的建立

基于转基因玉米TC1507旁侧序列信息，用Beacon Designer Software (Version 7.2， PREMIER Biosoft International)软件设计相应引物和探针(表1)。经过优化，反应体系中包括1×HR qPCR Master Mix，400 nmol·L-1上下游引物，200 nmol·L-1探针，5 μL模板，用双蒸水补至25 μL。定量PCR扩增程序为：95 ℃预变性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共45个循环。

1.4 标准曲线的建立

利用6个浓度梯度的pTC1507质粒DNA梯度稀释液(包括5×100、5×101、5×102、5×103、5×104、5×105copies·μL-1)，建立转基因玉米TC1507转化体特异性检测体系和内标准基因zSSIIb检测体系的标准曲线。

表1 转基因玉米TC1507质粒标准物质研制所用引物和探针

1.5 均匀性检验

采用Real-time PCR方法对质粒DNA标准物质的内外源片段拷贝数的均匀性进行考察。根据国家一级标准物质技术规范(JJG 1006—1994)的要求进行项目检测，质粒DNA标准物质pTC1507是液体，应属于均匀性良好的样品；当总体单元数小于500时，抽取单元数不少于10个。取样单元为15管，每个取样单元管内，随机取样3份，检验均匀性。在随机抽取的15个样本中，每一份均以荧光实时定量法检测TC1507 3′转化体特异性序列和内标准基因zSSIIb序列，各目标序列平行测定3次。

1.6 稳定性检验

稳定性检验包括长期和短期稳定性测试，均采用Real-time PCR方法对质粒DNA标准物质的内外源片段拷贝数进行测定。短期稳定性测试选取不同温度(-20、4、20和37 ℃)，不同时间点(0、1、2、4和8周)进行测试，每次每个浓度梯度随机选取4瓶，每瓶取样3份(N=4，n=3)。长期稳定性测定温度为4 ℃和-20 ℃，在不同时间点(1、2、4、6月)每次每个浓度梯度取样随机选取4瓶，每瓶取样3份(N=4，n=3)。

1.7 定值

pTC1507标准物质的定值采用测序和实时荧光定量PCR两种不同技术原理的方法进行。

测序定值是随机抽取3份pTC1507质粒DNA标准物质，分别送上海桑尼生物科技有限公司、上海英骏生物技术有限公司、宝生物工程(大连)有限公司三家测序技术服务公司进行全序列分析，确定质粒DNA标准物质中TC1507转化体特异性序列和内标准基因zSSIIb序列的拷贝数比值。

荧光定量PCR法定值，是利用建立的标准曲线方程测定pTC1507质粒标准物质不同浓度梯度条件下的拷贝数，计算插入的外源TC1507转化体与玉米内源zSSIIb序列的拷贝数之比。

1.8 不确定度评估

2 结果与分析

2.1 质粒标准分子的构建与序列鉴定

克隆得到适于转基因玉米转化体特异性检测的质粒分子pTC1507(图1)。通过限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ对质粒DNA进行酶切，预期酶切产物为4 379 bp和1 574 bp的片段，与电泳产物大小基本相符(图2，泳道2与4)。通过核酸内切酶NcoRⅠ和SpeⅠ对质粒DNA进行酶切，预期产物为5 679 bp和256 bp的片段，与电泳产物大小基本相符(图2，泳道1与3)。

将质粒分子pTC1507进行测序比对，通过三家公司的测序结果，分别对质粒分子pTC1507的序列与公开发表的序列进行比对，结果完全一致。结果证实，质粒分子pTC1507含有正确插入的目标序列，可进行进一步分析和鉴定。

图1 质粒分子pTC1507图谱Fig.1 The schematic diagram of pTC1507

泳道1、3表示EcoRⅠ和XbaⅠ酶切结果；泳道2、4表示NcoRⅠ和SpeⅠ酶切结果；泳道M， DL2000 DNA分子量标准。Lane 1， 3 represented double enzyme digestion electrophoretogram with EcoRⅠ/XbaⅠ; Lane 2， 4 represented double enzyme digestion electrophoretogram with NcoRⅠ/SpeⅠ; M， DL2000 DNA marker.图2 质粒分子pTC1507的酶切图谱Fig.2 Enzyme digestion of pTC1507 plasmid

2.2 标准曲线的建立

当以TC1507 3′端转化体特异性序列为扩增目标时，标准曲线计算获得的方程为：Ct=-3.156 1×lg(conc)+39.536；当以内标准基因zSSIIb为扩增目标时，通过标准曲线计算获得的方程为：Ct=-3.206 8×lg(conc)+41.386，其中conc表示浓度。

2.3 均匀性检验

本研究共制备了500管1×106拷贝的质粒分子标准物质(每管500 μL)，取样单元为15管。经荧光实时定量法测得均匀性数据后，通过F检验法对其进行分析(表2)，Fα(0.05)的值为2.01，TC1507与zSSIIbF值均小于2.04，据此判断质粒标准物质TC1507在瓶间和瓶内无显著差异，均匀性良好。

2.4 稳定性检验

2.4.1 短期稳定性考察

pTC1507质粒DNA标准物质短期稳定性考察结果见图3，短期稳定性的结果显示制备的pTC1507质粒DNA标准物质在4 ℃和-20 ℃具有良好的短期稳定性。

2.4.2 长期稳定性考察

pTC1507质粒DNA标准物质长期稳定性考察结果见图4，长期稳定性的结果显示制备的pTC1507质粒DNA标准物质在-20 ℃可以稳定存放使用6个月。

2.5 定值

基于荧光定量PCR法，通过已建立的标准曲线方程计算各浓度梯度测定结果的拷贝数。计算插入的外源TC1507转化体特异性序列与玉米内源zSSIIb序列的拷贝数之比，结果平均值为1.01，SD值为0.053，拷贝数结果偏差较小，说明插入的两个目标片段拷贝数之比基本为1.01(表3)。且三家专业的测序技术服务对pTC1507质粒DNA标准物质测序结果显示，pTC1507质粒DNA标准物质中的TC1507转化体特异性序列和内标准基因zSSIIb序列的拷贝数比值为1。

图3 pTC1507质粒短期稳定性测试Fig.3 Short term stability evaluation of plasmid reference material pTC1507

2.6 不确定度评定

计算不确定度的各分量，结果显示，定值带来的不确定度uchar=0.0072，均匀性带来的不确定度SH的值均小于S2的值，表明样品具有良好的均匀性，量值稳定；稳定性带来的不确定度ST，用格拉布斯法从统计上剔除可疑惑值，结果表明，在监测时间内稳定性变化较小，量值稳定。由各分量合成的总体不确定度uCRM为0.06。合成标准不确定度乘以扩展因子4.30得扩展不确定度U为0.258。具体值见表4。

图4 pTC1507质粒长期稳定性测试Fig.4 Long term stability evaluation of plasmid reference material pTC1507

表3 质粒标准物质TC1507拷贝数定值

表4 pTC1507质粒标准物质标准值和不确定度

3 讨论

目前，转基因检测标准物质根据其性质和制备过程等主要分基体标准物质和质粒DNA标准物质两类[8]。基体标准物质是一类用原始植物材料制成的标准物质，一般将纯合的转基因植物材料和非转基因材料根据一定的质量比例混合配制而成，在PCR检测过程中用作阳性对照和标准品，对实际样品中转基因成分进行量化和分析。基体标准物质与待测样品的成分相似性较高，制备过程不涉及加工处理，稳定性较高。但基体标准物质的缺点是，需要严格筛选高纯度的纯合原材料，制备过程技术要求高，成本高昂，周期较长，而且一种基体标准物质只能检测对应的一种转基因样品。而质粒DNA标准物质能够克服这些缺点，质粒分子标准物质是一种含有外源目的基因和内标准基因特异性片段的重组质粒分子，在转基因成分量化分析中是很好的基体标准物质替代物[9]。但质粒标准物质储存时容易受温度、浓度等因素影响[10]。

本研究研制了转基因玉米TC1507转化体特异性的质粒分子标准物质，包括质粒分子构建、质粒标准物质候选物制备、质粒标准物质分装、均匀性测试、稳定性测试、定值和不确定度评估等。研究结果表明，转基因玉米TC1507质粒分子标准物质能够较好地应用于转基因玉米TC1507及其加工品的定性、定量检测分析，为获得准确、可靠、具有可比性的转基因检测结果提供保障。