消化道皮肤素D介导的细胞焦亡与心力衰竭

2021-03-31杨昆鹏王立平黄菊陈冬雪赵鹃

国际心血管病杂志 2021年2期

杨昆鹏王立平黄菊陈冬雪赵鹃

心力衰竭(心衰)是大多数心血管疾病的终末阶段，严重威胁人类健康[1]。心衰的主要病理生理学机制较为复杂，包括心室重构、炎性反应、神经内分泌系统激活、氧化应激等，其中，炎性反应在心衰的发生发展中发挥重要作用[2]。细胞焦亡是近年发现的一种新型促炎性程序性死亡，与多种心血管疾病的发生发展有关；消化道皮肤素D(GSDMD)是细胞焦亡的中枢效应蛋白，可能参与上皮细胞的发育、凋亡、炎性反应、癌变及免疫系统疾病等多个病理生理过程[3]。

1 GSDMD蛋白

1.1 GSDMD蛋白的结构

Gasdermins(GSDMs)家族是近年发现的蛋白家族，包括GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME和Pejvakin(PJVK，又称DFNB59)等6种蛋白，GSDMD是目前研究最多的蛋白，并在细胞焦亡中发挥关键作用。2015年，Shi等[4]利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，分别对小鼠巨噬细胞中胱天蛋白酶(caspase)-1和caspase-11介导的细胞焦亡途径进行全基因组范围的遗传筛选，证实了GSDMD的存在。

GSDMD由3部分组成：(1)含242个氨基酸的N末端结构域(GSDMD-NT)；(2)含43个氨基酸的结构域连接物；(3)含199个氨基酸的C末端结构域(GSDMD-CT)[5]。GSDMD特殊的双结构域可起到自抑制作用，即GSDMD-CT与GSDMD-NT结合可以相互抑制[6]。GSDMD经caspase-1/4/5/11裂解后，去除了GSDMD-CT及其自抑制作用，释放出具有成孔活性的GSDMD-NT。Kayagaki等[7]研究发现，GSDMD-NT过表达可以加速细胞焦亡过程，而完整的GSDMD或切割后形成的GSDMD-CT不具有细胞毒性，且胞质中GSDMD-CT的表达水平显著高于GSDMD-NT[8]。Aglietti等[9]研究发现，GSDMD活化后，GSDMD-CT溶解在胞质中，而GSDMD-NT则结合在脂质体上。Ding等[10]研究发现，GSDMD-NT可以特异地结合在以磷脂酰肌醇或心磷脂为主要成分的质膜的脂质体上。这些研究提示GSDMD-NT能够与生物膜结合。

1.2 GSDMD的成孔作用

在Caspase介导的炎性反应中，GSDMD裂解可去除无活性的GSDMD-CT，释放出有活性的GSDMD-NT。Liu等[11]观察到GSDMD-NT是高分子量低聚物，可以在非还原性或天然聚丙烯酰胺凝胶上进行迁移，表明GSDMD-NT的齐聚性质。经过差速离心，高分子量GSDMD-NT低聚物仅存在于细胞膜组分中，而完整的GSDMD存在于胞浆中，免疫荧光共聚焦显微镜下可见GSDMD-NT能从细胞浆向细胞膜迁移。

蛋白质脂质结合分析结果显示，GSDMD-NT可以与细胞膜的成分磷脂酰肌醇磷酸酯、磷脂酰肌醇、磷脂酸以及磷脂酰丝氨酸等结合。Ding等[10]在脂质体渗漏试验中发现，GSDMD-NT能够分解含有磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇单磷酸、磷脂酰肌醇二磷酸或心磷脂的脂质体膜，表明GSDMD-NT可在脂质双层上打孔，从而破坏细胞。采用负染色电子显微镜观察GSDMD-NT对脂质体的作用时，可观察到GSDMD-NT在脂质体的胞膜上形成内径15 nm、外径32 nm的环状孔洞，证实GSDMD-NT在质膜上可以形成足够大的孔洞，有利于直径≤10 nm的小分子自由通过。

2 细胞焦亡

细胞焦亡是伴随炎性反应的细胞程序性死亡方式[12]，需要依赖caspase-1/4/5/11的活性，这是与细胞凋亡的区别所在。细胞焦亡的特征包括GSDMs家族介导的质膜孔洞形成，细胞肿胀，质膜破裂，细胞内促炎性细胞因子如白细胞介素(IL)-1β、IL-18、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的释放等[13]。GSDMD作为细胞焦亡的直接和最终执行者，在被caspase-1/4/5/11激活后，裂解形成GSDMD-NT，通过在细胞膜上形成孔洞触发细胞焦亡的发生。

炎性小体是免疫系统的重要组成部分，在多种免疫细胞中表达并可被多种因子激活，引发细胞焦亡。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)是研究较为广泛的炎性小体，可以识别细菌等病原体相关分子模式(PAMP)，也可以识别胆固醇等危险相关分子模式(DAMP)。在经典的细胞焦亡途径中，NLRP3可被PAMP和DAMP激活，继而与凋亡相关斑点样蛋白(ASC)结合并招募caspase-1前体组成NLRP3炎性体，活化caspase-1。活化后的caspase-1一方面可切割IL-18前体(pro-IL-18)和IL-1β前体(pro-IL-1β)，使其成为有活性的IL-18和IL-1β，另一方面也可以切割GSDMD形成GSDMD-NT和GSDMD-CT，GSDMD-NT与细胞内膜结合形成孔洞，导致细胞膜结构破坏，IL-18和IL-1β等细胞因子释放，引起细胞焦亡(见图1A)[11]。在非经典的细胞焦亡途径中，人的caspase-4/5和小鼠的caspase-11在识别并结合脂多糖后被激活，活化的caspase-4/5/11既能通过裂解GSDMD诱导细胞焦亡，又能通过GSDMD-NT激活caspase-1，从而介导经典途径细胞焦亡的发生，这间接表明经典与非经典途径细胞焦亡相互联系并可相互转化(见图1B)[14]。

注：A为经典途径；B为非经典途径；PAMP为病原体相关分子模式；DAMP为危险相关分子模式；LPS为脂多糖；GSDMD为消化道皮肤素D；IL-18为白细胞介素-18；IL-1β为白细胞介素-1β；NLRP3为核苷酸寡聚化结构域样受体蛋白3；caspase为胱天蛋白酶；ASC为凋亡相关斑点样蛋白

3 GSDMD介导的细胞焦亡在心衰形成中的作用

GSDMD作为细胞焦亡经典与非经典途径中的共同底物和执行者，介导的细胞焦亡往往伴随着大量细胞因子的产生，这些细胞因子可以通过各种方式使心肌细胞受损、心肌功能紊乱、心室重构，最终导致心衰。Murphy等[15]研究发现，抑制炎性反应可以减少细胞因子的产生，从而减少心肌细胞死亡数量，改善心衰患者的心功能。

3.1 NLRP3与心衰

NLRP3炎性小体是大分子多蛋白复合体，在细胞焦亡途径中发挥重要作用。研究发现，当心肌细胞压力超负荷时，在钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca+/CaMKⅡ)信号通路的介导下，NLRP3炎性小体等炎性因子激活，并参与心室重构的病理过程[16]。Bai等[17]发现NLRP3炎性小体等的激活可以加速氧化应激及心血管内皮细胞功能障碍，导致组织水肿、血栓形成及慢性炎性反应，加速心衰等心血管事件的发生。Li等[18]在小鼠实验中发现，抑制NLRP3炎性小体可以减轻心脏炎性反应及纤维化，改善心脏的收缩与舒张功能，从而改善心室重构。NLRP3炎性小体可促发下游IL-18及IL-1β等的成熟与释放，该反应可被肿瘤坏死因子(TNF)-α及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)放大，引起炎性级联瀑布反应；NLRP3还可导致促纤维化基因的表达，使心脏功能受损，NLRP3炎性小体在心衰发生发展中起着至关重要的作用[19]。

3.2 IL-18与心衰

IL-18是广泛存在于血管内皮细胞、平滑肌细胞及巨噬细胞上的具有多种生物学特性的炎性细胞因子，在基础状态下以前体的形式存在于细胞中，在组织损伤等应激反应时可以迅速释放入血。O′Brien等[20]研究发现，IL-18在心衰中发挥重要作用，可作为心衰的治疗靶点，使用IL-18抑制剂可减缓心衰的进展。Segiet等[21]的研究阐明IL-18等相关细胞因子在心肌损伤到心衰转变过程中的重要性，IL-18可作为心衰标志物及死亡率的预测指标。IL-18致心衰的机制尚不完全清楚，推测其可能与下列因素有关：IL-18可以通过诱导TNF-α、IL-1β及IL-6等促炎性细胞因子的产生，导致心肌细胞肥大、心腔扩张及心肌细胞凋亡；IL-18可与相关受体结合，促使心肌肥厚，影响心脏收缩力；IL-18可直接激活细胞毒性T淋巴细胞，使心脏射血分数下降，进一步导致心功能不全。

3.3 IL-1β与心衰

IL-1β又称淋巴细胞活化因子，是较强的促炎性细胞因子，主要由活化的巨噬细胞产生，活化后可通过多种途径参与心衰的发生发展。Harouki等[22]利用大鼠构建心衰模型发现，IL-1β可使心肌胶原蛋白累积，心肌活性氧水平增加，从而加速心衰进程。给予大鼠皮下注射IL-1β拮抗剂，可有效减轻氧化应激及炎性反应，延缓心室重构，提高射血分数，这与Shang等[23]的报道相吻合。有报道称在小鼠心室肌细胞中，IL-1β可降低L型钙通道的密度，影响钙离子内流，从而影响心肌收缩力，诱发心律失常与心衰[24]。IL-1β在心衰患者的疾病进展及预后评估中发挥重要作用，但是IL-1β在心衰病理生理中的具体机制尚未完全证实。

3.4 HMGB1与心衰

HMGB1是GSDMD参与介导的细胞焦亡途径中的重要炎性细胞因子，广泛分布于心、肝、肺等多种脏器及组织中，可作为反映心衰患者心肌细胞炎性反应活动度的指标。有研究报道，慢性心衰患者血清HMGB1水平显著升高，且HMGB1水平与N末端脑钠肽前体(NT-proBNP)呈正相关，与射血分数呈负相关，并且认为HMGB1水平可以作为慢性心衰患者危险分层的新型指标[25]，这与Marsh等[26]的研究结果有相似之处。Lin等[27]研究发现，在心肌细胞缺血再灌注损伤小鼠模型中，HMGB1水平显著升高，并且伴随IL-1、IL-6、TNF-α等炎性细胞因子的升高，HMGB1抑制剂丙酮酸乙酯可以有效降低HMGB1水平，减轻炎性反应程度，改善心功能。

4 GSDMD的靶向治疗策略

由于GSDMD诱导的孔洞形成可能是许多疾病发生和发展的关键环节，确定靶向GSDMD的药物具有重大意义。研究发现，GSDMD抑制剂坏死磺酰胺(NSA)可与C191氨基酸结合，抑制GSDMD-NT结构域的低聚化[28]。Rashidi等[29]测试NSA对尿酸晶体的反应时，发现NSA具有调控GSDMD上游因子ASC聚集的作用，可阻止外源性脂多糖的刺激，降低IL-1β前体(pro-IL-1β)的表达。Hu等[30]研究发现，治疗酒精成瘾的药物双硫仑也是脂质体中GSDMD孔洞形成的抑制剂。双硫仑虽然不影响IL-1β和GSDMD的活化，但可作用于C191/192的残基，阻断孔洞的形成，从而阻止IL-1β释放和细胞焦亡的发生。

Do Carmo等[31]发现VX-765是一种高度选择性caspase-1抑制剂，可以减少缺血再灌注损伤模型中梗死心肌细胞数量。此外，VX-765提供的保护作用超过了单纯使用血小板抑制剂的作用[32]。Audia等[33]研究发现，VX-765与P2Y12受体拮抗剂联合使用，可缩小心肌梗死范围并保护左室功能。