不同组织分离期对大圆头蛹虫草菌种性能的影响

李剑梅，冯 敏，谢存一，柴林山，朱万芹，张疏雨

(辽宁省微生物科学研究院，辽宁 朝阳 122000)

蛹虫草(Cordycepsmilitaris(Vuill.)Fr.)也称北虫草,属于子囊菌亚门(Ascomycotina)麦角菌科(Clavicepitaceae)虫草属(Cordyceps)，是我国一种兼具食用和药用珍贵价值的优质大型真菌[1-3]。经研究证实，其化学成分与冬虫夏草相近，含有虫草素、虫草酸、氧化物歧化酶(SOD)、喷司他丁、麦角甾醇等生物活性物质及蛋白质、氨基酸、维生素及钙、锰、锌、硒等微量元素，具有滋补营养、增强免疫及抗肿瘤、抑制病毒、抗辐射、抗菌消炎等多种营养、保健及药用功能[4-8]。蛹虫草是目前公认的食药用虫草之一，在我国已经形成了一个巨大的产业，年产值可达100亿元人民币[9],栽培品种主要有尖头蛹虫草、大圆头蛹虫草。其中，大圆头蛹虫草因子实体顶端膨大、呈蝌蚪状而得名，具有色泽金黄、子囊孢子丰富、口感鲜脆、香味浓郁等特点，深受广大消费者喜爱，在我国内蒙古赤峰等大部分地区广泛栽培。菌种退化是菌类栽培过程中普遍存在的问题，蛹虫草菌株在继代培养和保藏的过程中容易退化[8-9]。大圆头蛹虫草是通过人工驯化及科学管理而获得的栽培品种，菌种容易变异和退化，保存期短，已成为其规模化人工栽培关键技术瓶颈之一。菌种质量是蛹虫草人工栽培成败的前提条件，研究和建立科学有效的优良母种选育方法，选育、保持大圆头蛹虫草优良菌种性能，对大圆头蛹虫草规模化生产具有重要意义。研究表明，组织分离法是一种常用食用菌菌种繁殖方法，具有操作简单等优点[10]。本研究从生产实际出发，采用组织分离方法，对不同组织分离期的大圆头蛹虫草菌种性能进行了比较试验研究，明确其组织分离最佳时期，为提高大圆头蛹虫草人工栽培用优良生产母种筛选效率，提升菌种质量提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 大圆头蛹虫草(Cordycepsmilitaris)不同生长发育时期子实体，由辽宁省微生物科学研究院药用蕈菌研究室提供。

1.1.2 培养基 ①PDA加富培养基：土豆200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨1 g，MgSO40.5 g，KH2PO41 g，琼脂16 g，加蒸馏水至1 000 mL，pH 6.5，121 ℃保持15 min；②液体种子培养基：土豆200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨1 g，MgSO40.5 g，KH2PO41 g，琼脂16 g，加蒸馏水至1 000 mL，pH 6.5，121 ℃保持15 min；③人工栽培培养基：以650 mL罐头瓶为培养容器，每瓶装培养料40 g(小麦∶豆粕=8∶1)，按照1∶1.7(g/mL)的比例添加营养液(葡萄糖10 g, MgSO41 g,KH2PO42 g，蛋白胨5 g,VB15 mg，配制成1 000 mL溶液，pH自然)，用聚丙烯塑料膜包裹瓶口，再用橡皮筋扎紧，121 ℃保持1 h。

1.1.3 主要仪器与设备 立式压力蒸汽消毒器(LDZX-75KBS，上海申安医疗器械厂)；超净工作台(SW-CJ-2，江苏苏静仪器仪表有限公司)；电热恒温培养箱(DHP-PZ72，上海一恒科技有限公司)；生物显微镜(CKX41，OLYMPUS日本)。

1.2 方法

1.2.1 实验用子代母种组织分离 选取培养时间分别为35 d(无有性孢子期)、40 d(子囊壳形成初期)、45 d(子囊孢子形成初期)、50 d(子囊孢子成熟期)发育良好、生长健壮、无污染的大圆头蛹虫草新鲜子实体，用75%酒精对培养瓶表面进行消毒，无菌打开栽培瓶的封口膜，取出供试新鲜子实体于无菌培养皿中，用无菌手术刀取子实体头部膨大部分，去除表皮并无菌切成0.2 cm的小段，用接种针接入预先制备好的PDA加富平板培养基上，18 ℃恒温、避光培养，当组织块在培养基上形成直径1.5 cm菌落时，挑取生长健壮的菌落边缘菌丝于预先制备好的PDA斜面培养基上，每个组织分离期制备纯化菌株25株，18 ℃避光、恒温培养至菌丝长至1/2斜面，获得实验用子代母种，备用。

1.2.2 不同组织分离期对子代母种菌丝生长性状的影响 无菌挑取2 mm2大小的实验用子代母种新鲜菌种块，分别接种于PDA加富平板培养基上，18 ℃避光、恒温培养，依次观察各组母种菌丝色泽、长势、转色、生长速度等情况，对各组供试菌株菌丝生长性状优良率进行差异化分析，考察不同组织分离期对子代母种菌丝生长性状的影响。各组子代母种优良率(%)=(生长性状优良菌株数/子代母种总数(25))×100%。

1.2.3 不同组织分离期对子代母种液体培养性状的影响 另取上述各母种，无菌挑取1 mm2大小的菌种块3～4块，转接至装有100 mL液体培养基的 500 mL三角瓶内，18 ℃、140 r/min，避光培养4 d，以菌球及发酵液表观形态、生物量为考核指标，计算各组供试菌株菌种优良率，考察不同组织分离期对子代母种液体菌种培养性状的影响。生物量测定采用恒重称量法，即将培养好的液体菌种经纱布过滤，然后用适量的蒸馏水洗涤3次，收集菌丝体置于已知重量的称量瓶中，105 ℃烘干至恒重，称量，按照下式计算生物量(以每100 mL发酵液中菌丝体干重表示)。

式中：W1为菌丝体与称量瓶质量和(g)；W0为称量瓶质量(g)；V为发酵液体积(mL)。

1.2.4 在麦粒培养基上各子代母种菌丝培养性状及子实体形成能力的比较 取培养好的子代母种的液体菌种，分别无菌喷洒于栽培培养基料面上，置于人工气候室18 ℃、避光、空气相对湿度不低于35%环境条件下培养15 d左右，当培养基表面形成菌丝被，且菌丝被表面有明显龟被纹时，搔菌转色，24 h给予300 lx的光照，20 ℃、空气相对湿度不低于50%、二氧化碳浓度低于0.5%条件下培养3～4 d，诱导原基形成；当搔菌沟内现淡黄色原基时，用接种针在封口膜上扎眼通气(扎两排孔，每排扎3个直径约0.2 mm的小孔)，继续培养至60～65 d，子实体头部膨大呈球形且着生丰富的子囊壳，表明子实体已经成熟，即可获得子代母种子实体。在子实体培养过程中，观察比较各组子代母种在栽培培养基上菌丝长势、菌丝被表观形态、转色能力、子实体形态、产量及比例，对不同组织分离期子代母种在麦粒培养基上培养性状及子实体形成能力进行比较分析。子实体产率计算方法：

2 结果与分析

2.1 不同组织分离期对子代母种菌丝生长性状的影响

结果表明，试验范围内，在PDA加富平板培养基上，组织分离期为35、50 d的子代母种生长速度明显低于对照母种，在菌丝长势及转色能力方面，菌种优良率较低，与组织分离期为40、45 d的子代母种相比，形成了明显差异。以40、45 d子实体为分离材料所获得的子代母种生长速度、菌丝长势与对照母种最为相近，绝大多数菌株菌丝健壮、浓密且爬壁能力、转色能力较强，菌种优良率达到90%以上；其中以组织分离期40 d的子代母种菌丝生长速度最快(3.187 mm/d)，菌丝健壮、浓密、匍匐状，转色均匀、淡黄，菌种优良率最高，除1株子代母种菌丝长势弱外，其余菌株具有与对照母种相近的良好生长性状，菌种优良率达到96%。由此可见，不同组织分离期对子代母种在斜面培养基上生长性能具有一定的影响，组织分离期为40 d的子代母种较好地保持和遗传了对照母种的生长性能。这主要是由于该时期子实体头部形成丰富的子囊壳，处于子囊孢子形成早期，菌丝体细胞处于分化能力最强及活力最高时期，在该时期进行组织分离得到的母种活力及长势最好(表1)。

表1 不同组织分离期制备的母种在斜面培养基上的生长性能比较

2.2 不同组织分离期对子代母种液体培养性状的影响

液体菌种的培养是蛹虫草人工栽培的重要环节，蛹虫草液体菌种长势是子实体培养成败的前提条件。试验以母种为对照，对不同组织分离期获得的子代母种液体培养性状进行了差异化比较试验。结果表明，不同组织分离期的子代母种液体菌种培养性状分化程度存在一定的差异；其中35 d组织分离期子代母种液体菌种培养性状分化明显，液体菌种优良率仅为76%，45、50 d组织分离期子代液体菌种优良率分别为88%、84%，40 d组织分离期子代母种液体菌种培养性状一致性最好，90%以上的子代母种生物量(≥3.1%)高于对照母种(3.1%)，且其液体菌种培养性状与对照母种相同，菌球较细密均匀、菌液黏稠；结果表明，各子代母种液体培养性状优良率差异与其在PDA加富平板培养基上菌丝生长性能差异基本一致，二者明显正相关，这主要是由于蛹虫草菌株在适宜的液体培养条件下，优良子代母种的菌丝生命力旺盛、生长迅速，且组织分离法为无性繁殖，不易产生遗传物质变异，其子代母种菌丝优良的培养性状得到稳定遗传(表2)。

表2 不同组织分离期子代母种液体培养性状的比较

2.3 麦粒培养基上各子代母种培养性状及子实体形成能力比较

栽培试验是全面检验菌种性能的根本方法,出草情况是菌种综合性能的全面反映[7]。在大圆头蛹虫草实际生产过程中，在麦粒培养基上，优良的大圆头蛹虫草菌种菌丝长势旺盛，形成厚0.5～1.0 cm的菌丝被，在适宜条件下，避光培养15 d，菌丝扭结形成典型的龟背纹，见光后菌丝转色成均匀的淡黄色，子实体通体金黄，头部膨大呈球形，子实体蝌蚪状，且密度适中，整齐一致(图1)。

图1 大圆头蛹虫草优良母种在麦粒培养基上的长势

栽培试验结果(表3、表4)表明：组织分离期为40 d的子代母种培养性状表现最优，45 d次之，50 d最差。组织分离期为40 d的子代母种中，92%子代母种与对照母种菌丝长势相近，菌丝长势旺盛，菌丝被较厚，84%的子代母种在菌丝被表面形成典型龟背纹，见光转色迅速、均匀，子代母种培养性状优良率达到了84%。实验结果还说明：试验菌株子实体形成能力与菌种培养性状表现出显著的相关性，组织分离期40 d的子代母种优良菌株筛选率最高(48%)；45 d次之(44%)，50 d最低(32%)；并且在各组子代母种中，以菌丝长势旺盛、菌丝被较厚的各组子代母种子实体形成能力表现最优，多数菌株与对照母种相似，在菌丝被表面形成典型的龟背纹，见光后菌丝迅速转色成均匀的淡黄色，形成的子实体商品性状良好；菌丝长势极旺盛、菌丝被厚的子代母种则分化明显，多数菌株菌丝气生性强、菌丝被厚且无龟背纹、转色不均一或不转色，子实体形成能力也较弱；而菌丝长势弱、菌丝被薄的试验菌株均无典型的龟背纹，转色能力及子实体形成能力差，不能形成正常子实体。菌种分化主要是由于蛹虫草菌株具有较强的遗传不稳定性，在菌种分离及人工培养过程中，部分菌株由于营养条件、环境条件等方面的影响，造成可育性控制基因丢失，出现菌丝徒长、败育等现象。综合各组子代母种在栽培实验中菌种性能表现，以组织分离期为40 d的子代母种性能最优，这一结果与各组子代母种菌丝生长性状及液体培养性状考察结果一致。因此，大圆头蛹虫草菌种组织分离最佳分离期为40 d。

表3 不同组织分离期子代母种在麦粒栽培培养基上培养性状的比较

表4 不同组织分离期子代母种在麦粒栽培培养基上子实体生长情况的比较

3 讨 论

组织分离法可较好地保持和遗传母种的优良性状，且操作较为简便，遗传变异性较低，是大圆头蛹虫草母种筛选及复壮的重要手段之一。试验通过对不同组织分离期(35、40、45、50 d)子代母种平板培养、液体培养及栽培实验，对不同组织分离期子代母种性能进行了科学评价，综合各组子代母种在PDA加富平板培养基的菌丝生长性状、液体培养性状及栽培实验考察结果，以40 d子代母种优良菌种筛选率最高(48%)，45 d次之(44%)，50 d最低(32%)，明确了大圆头蛹虫草菌种组织分离最佳分离期为40 d。

相关研究证明，蛹虫草菌种特别容易退化，一般经过一段时间保藏或传代，其菌种性能可发生严重衰退，产量及活性物质含量显著降低，甚至不转色、不形成子实体，需经常对菌种进行复壮或选育[14-15]。试验中发现，大圆头蛹虫草子代母种子实体形成能力与其培养性状具有显著相关性，且优良的子代母种具有与试验对照母种相近的培养性状，在PDA加富培养基上菌丝健壮、浓密、爬壁能力强、转色均一，液体培养条件下菌球细密、黏度适中，在麦粒培养基上可形成厚度适中的菌丝被，并形成典型的龟背纹，见光后转色迅速均匀，子实体整齐、形态好、产量高。因此，在大圆头蛹虫草菌种选育、复壮过程中，可依据优良子代母种在各培养时期的培养特性，对所获子代母种性能进行预判，淘汰可育性较差的菌株，进而减少工作量，提高菌种选育效率。试验结果可为大圆头蛹虫草优良菌种选育、复壮提供参考。