ctDNA对TKI靶向治疗EGFR突变型肺腺癌疗效及预后的预测价值

朱立才 李明娟 王英 韩博学 甘乐文

2018年数据[1]显示，在所有新发癌症中，肺癌约占11.6%，且死亡率较高，是全球肿瘤发病率及死亡率最高的癌症类型之一。我国肺癌群体中约有80%为非小细胞肺癌(NSCLC)，因其发病隐匿，临床确诊时，约有55%患者已出现远处转移，5年生存率较低，仅为10%～15%[2]。近年来，随着靶向药物应用于治疗NSCLC，如表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)，获得较好的疗效。Rosell等[3]研究发现，将第一代TKI应用于EGFR敏感突变晚期NSCLC患者，可延缓病情进展，延长无进展生存期，提高患者生活质量。Camidge等[4]将第一代TKI应用于EGFR敏感突变患者，治疗效果显著，无进展生存期为10～16月。但临床研究[5]发现，采用第一代TKI治疗NSCLC，易出现耐药问题，主要是T790M基因突变引起。第三代TKI的出现，有效的解决部分因T790M基因突变引起的TKI耐药，进而提高了NSCLC治疗效果，但影响TKI治疗EGFR突变型NSCLC患者的治疗效果因素较多，如ERBB2表达蛋白扩增、BRAF基因突变、PTEN基因失活、ALK基因表达等[6]。Wang等[7]研究发现，对12例EGFR突变肺癌患者予以TKI治疗，收集不同时间段患者的外周血进行ctDNA测序，结果发现约50%患者T790M水平升高，治疗过程中2例患者出现上皮间质转换现象，1例患者RB1失活，1例患者RB1基因突变，结果说明引起TKI耐药的机制不同，并且在肿瘤发生的不同阶段，基因突变也不同。为更好解决以上问题，我们需要了解NSCLC患者在治疗过程中基因水平变化，明确是否有耐药基因产生，了解治疗效果；另外，对于治疗后肿瘤进展，无法通过穿刺获得病理组织。随着血循环肿瘤DNA(ctDNA)测序技术的发展，能够很好的解决上述难题。通过对比治疗前后ctDNA变化，能够作为一个评估TKI治疗效果的潜在指标[8]。特此本研究纳入我院20例采用TKI治疗的EGFR基因突变型肺腺癌患者，采用ctDNA测序技术检测治疗前后基因变化，进而预测治疗效果，为TKI靶向治疗NSCLC的预后评价提供依据。现报道如下。

资料与方法

一、一般资料

本次研究经我院伦理委员会审核批准。纳入标准：(1)年龄>18岁；(2)病理学检测诊断为NSCLC(腺癌)，临床分期为Ⅲb-Ⅳ期；(3)无化疗、生物、免疫治疗史；(4)无恶性疾病史；(5)预计生存期超过3个月。排除标准：(1)伴有其他恶性肿瘤；(2)伴有EGFR-TKI原发耐药者；(3)预计生存期≤3个月。根据以上纳入排除标准，选取我院在2017年1月至2018年1月期间收治的20例肺腺癌患者作为研究对象。其中，男9例，女11例，年龄为39～77岁，平均年龄(60.51±12.34)岁(见表1)。患者均知情同意，试验设计符合《赫尔辛基宣言》标准。

表1 患者临床特征比较

二、方法

根据患者意愿，自愿选择在我国上市的TKI药物中的任意一种：吉非替尼250 mg/d，空腹口服，1次/天；厄洛替尼(特罗凯)150 mg/d，空腹口服，1次/天；埃克替尼(凯美)125 mg/d，空腹，3次/天。

三、观察指标

1 治疗效果评价[9]治疗后每4周对患者进行CT检查，依据WHO制定的肿瘤治疗效果评价标准评估治疗效果：完全缓解(CR)：肿瘤病灶消失，且4周内无新发病灶；部分缓解(PR)：肿瘤病灶缩小体积超过50%，且4周内无新发病灶；稳定(SD)：肿瘤病灶缩小体积不足50%，或肿瘤病灶增大不足25%；肿瘤进展(PD)：肿瘤病灶增大超过25%，或者出现新发病灶。研究主要终点为无进展生存时间(PFS)，即从治疗开始到客观肿瘤进展时间。

2 ctDNA检测 于治疗前1周、治疗后2月、临床评估肿瘤进展时，采集外周静脉血8 mL，离心(3 500 r/min，r=6 cm，5 min)获得血浆，此操作需在4 h内完成。ctDNA提取：采用ctDNA提取试剂盒(由美国QIAGEN公司提供)提起外周血ctDNA，操作步骤严格按照说明书执行；采用EGFR突变定性检测试剂盒(由北京雅康博公司提供)检测ctDNA的片段分布。

四、统计学分析

结 果

一、EGFR基因突变情况

入组患者治疗前13例患者EGFR 19位点缺失，7例患者EGFR21位点突变。治疗中出现TP53突变9例，JAK2突变2例，T790突变、L861Q突变各1例。具体数据(见表2)。

表2 治疗前EGFR基因突变情况

二、临床治疗效果

入组20例患者中，11例患者采用吉非替尼治疗，5例患者采用厄洛替尼治疗，4例患者采用埃克替尼治疗。随访2月，CR、PR患者共10例，SD患者6例，PD患者5例；随访24月，CR患者2例，PD患者18例，其中死亡9例(见表3、图1)。

表3 患者临床治疗效果

图1 生存曲线图

三、治疗前后外周血ctDNA水平变化

在治疗2个月后或者临床进展时，再次抽取患者外周静脉血，进行ctDNA测序，结果发现：与治疗前相比，治疗后EGFR突变频率丰度低于治疗前(P=0.016)(见图2)。合并TP53、突变的患者预后较差，无进展生存时间低于无TP53突变的患者(中位PFS为160天vs594天，P=0.000)。与无JAK2突变患者相比，JAK2突变患者预后较差，因突变数量较少，未统计中位PFS。治疗后，7例患者EGFR基因丰度变化不大(P=0.672)，临床疗效评估为部分缓解(1例)、稳定(6例)；合并TP53突变患者，经TKI治疗后，基因丰度增加，且临床治疗效果较差，提示部分患者可能存在TKI耐药(见图3)。

图2 治疗前后EGFR突变基因丰度变化

图3 治疗前后EGFR、TP53突变基因丰度变化

讨 论

EGFR为人类原癌基因c-erbB1的表达产物，能够激活酪氨酸激酶，在细胞生长、增殖、分化过程中具有重要的调节作用。研究发现，EGFR突变与肿瘤发生密切相关，Julie等[10]研究发现，EGFR突变包括EGFR激活突变、EGFR野生型、原发T790M突变型，并且他们的比值随着肿瘤进展而发生改变。随着靶向药物的出现，为EGFR突变型肿瘤患者治疗带来新的曙光，TKI为临床中常用的EGFR突变型肿瘤靶向药物之一，其通过阻断ATP与细胞内酪氨酸激酶结合，抑制EGFR受体磷酸化，进而阻断EGFR下游信号通路的激活，从而起到治疗的作用。

目前已有临床研究证实，在治疗NSCLC时，临床医师可结合ctDNA测序结果，制定靶向治疗策略。Nahar等[11]研究发现，约有65%NSCLC患者存在ctDNA突变，治疗上可予以靶向治疗，并且在治疗过程中可动态监测基因变化，进而调整治疗方案。Bettegowda等[12]研究发现，对NSCLC术后患者进行ctDNA测序，发现ctDNA在预测术后复发的敏感性为93%，高于传统影像学检查及肿瘤标记物检测。通过检查癌症患者血浆中携带肿瘤的特异性序列改变的DNA片段，即ctDNA，被认为是病理学检查的合理补充[13]。随着对ctDNA的研究深入，发现其在肿瘤残留体积、获得性耐药中具有重要作用，Abbosh等[14]等研究发现，ctDNA变化与EGFR-TKI治疗效果密切相关。因此，采用EGFR-TKI治疗时，动态监测ctDNA变化，能够较好的反映细胞克隆变化，为评估治疗效果或耐药性奠定基础。本次研究发现，采用TKI治疗EGFR突变型肺腺癌时，多基因片段ctDNA呈动态变化，对TKI敏感的突变基因频率降低，提示治疗有效，因此，我们初步认为可通过观察ctDNA特点靶点基因突变频率丰度变化，评估靶向治疗的效果。

本次研究发现，在治疗过程中有2例患者出现JAK2(p.V617F)基因突变。JAK-STAT途径在肺癌的治疗中的作用得到越来越多的人认识[15]。Tung等[16]研究发现，采用TKI治疗EGFR突变患者时，尤其是出现EGFR-TKI抵抗时，多合并JAK2突变，此时予以JAK2抑制剂，能够显著提高TKI治疗效果。另外，有研究报道TP53基因突变可影响TKI治疗EGFR突变型肺癌的治疗效果[17-18]。Labbé等[19]研究发现，105例NSCLC患者中，有43例患者出现TP54/EGFR双突变，并且这些患者的PFS、OS明显缩短，结果说明TP53突变于NSCLC患者预后密切相关。Shepherd等[20]研究发现，通过检测晚期肺腺癌患者TP53突变情况，结果发现40%患者为TP53型，60%患者为TP53野生型；对患者予以TKI治疗，发现TKI与TP53突变间有一个显著影响，TP53突变患者，其PFS明显缩短；后续对11例患者采用T790M抑制剂治疗，结果发现患者PFS无显著延长；结果说明EGFR突变型肺腺癌患者合并TP53突变，在接受TKI治疗时，其疗效欠佳，PFS缩短。本次研究虽然样本容量较少，但也得出同样的趋势。

基于以上结果，我们可以得出，通过检查TKI靶向治疗EGFR突变型肺腺癌患者不同阶段ctDNA，能够较好的评估治疗效果，其敏感基于突变丰度降低，提示治疗效果较好，提高患者预后。通过检测治疗过程中ctDNA变化，可了解治疗过程中肿瘤异质性变化，那些临床治疗效果评估为CR/PR的患者，其敏感突变基因丰度减低，提示肿瘤细胞可能以单一EGFR突变克隆为主；而临床治疗效果评估为SD/PD的患者，治疗后敏感基因丰度变化不大或者增加，可能提示肿瘤细胞为多种EGFR突变克隆。本研究所得出的上述结论还需进一步通过扩大样本量来验证，并且后续可以根据与本研究相关的其他基因通路的研究结果，进一步结合ctDNA的检测结果提出更精准的肿瘤个体治疗方案，为TKI靶向治疗NSCLC的预后评价提供依据。