不同比例氯化镧正畸粘接剂抗菌性和粘接性能的实验研究

缪 羽，王慧娟，韩 赫

（内蒙古医科大学第四附属医院口腔科，内蒙古 包头 014030）

固定矫治是目前正畸临床使用最普遍的方法，但是由于固定矫治器的托槽、弓丝及附件都会妨碍牙面的清洁，牙釉质脱矿成为固定矫治治疗中较多见的并发症之一，且发病率较高，经统计发现达20%～50%[2]。由于正畸治疗周期长、病人以依从性较差的青少年为主，正畸治疗期间成为牙釉质脱矿的高发期，若没有引起医生及病人的足够重视，就有可能导致龋齿的发生。因此，贯通于整个正畸矫治过程、不需要病人高度配合的措施更适合青少年病人。具有持续稳定防龋效果的粘接材料研究为牙釉质脱矿的预防提供了一个思路。

近年来稀土元素不仅备受现代高新技术产业的青睐，在农牧业、渔业、医疗方面也被广泛应用和研究。目前很多学者热衷于探索镧元素在烧伤、肿瘤、肾脏和口腔材料等领域的生物学作用，并且证实镧元素具有抗炎、抗菌和抗肿瘤等作用[3]。本研究在正畸粘接剂中添加氯化镧，并对其抗菌性能和粘接性能进行检测。为固定矫治时脱矿和龋病的预防提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

氯化镧（天津市科密欧化学试剂有限公司）；光固化型牙釉质粘合树脂（西湖巴尔，杭州西湖生物材料有限公司）；远缘链球菌（ATCC 33478，广东省食品微生物安全工程技术研究开发中心）；脑心浸出物培养基（BHI，广东环凯微生物科技有限公司）；琼脂（Agar，Biosharp 公司）；树脂改良型玻璃离子粘固剂（GC FujiOrtho LC，日本）；离体前磨牙（内蒙古医科大学附属包头口腔医院提供）；正畸直丝弓托槽（杭州新亚）；自凝树脂（上海二医张江生物材料有限公司）。

1.2 设备

LED 光固化灯（Elipar S10，美国3M 公司）；立式压力蒸汽灭菌器（SQ510C，重庆雅马拓科技有限公司）；电子天平（BSA124S-CW，北京赛多利斯科学仪器有限公司）；超净工作台（HFaafe-1200LC，力康生物医疗科技控股有限公司）；旋涡混合仪（XW-80A，海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；电热恒温培养箱（PYX-DHS-35 X 40，上海医疗器械七厂）；酶标仪（Multiskan GO，芬兰赛默飞世尔科技公司）；空气浴振荡器（HZQ-C，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）；万能试验机（CMT5101，深圳市新三思计量技术有限公司）；恒温水浴箱（DK-600S，上海精宏实验设备有限公司）；光学显微镜（SMZ1500，日本尼康）。

1.3 氯化镧正畸粘接剂的制备

精密电子天平称量1%、2%、3%、4%、5%质量分数的氯化镧与正畸光固化型牙釉质粘合树脂充分搅拌均匀，分别作为实验组A 组、B 组、C 组、D 组、E组，密封避光保存备用。不含氯化镧的正畸粘接剂为对照组F组。

1.4 正畸粘接剂抗菌性能测试

1.4.1 实验试件制备将六组光固化型粘合树脂制备为直径6mm，厚1mm 的圆柱状试件，A～F 组各20个，用无菌生理盐水冲洗试件表面以去除未固化的树脂单体，试件用75%酒精浸泡3min后置于超净工作台内，双面各经紫外灯光照射30min备用。

1.4.2 远缘链球菌的复苏和培养将冻干菌株远缘链球菌复苏后，使用接种环挑取形态特征明显的单菌落，接种于装有5mL BHI液体培养基的离心管中，置于空气浴振荡器中37℃恒温厌氧培养48h备用。

1.4.3 实验用菌液制备将1.4.2制备的远缘链球菌菌液在旋涡混合仪上混匀，移液器吸取菌液于酶标板孔中，测菌液OD540值，若OD540值小于1，则继续37℃恒温厌氧培养直到OD540值大于或等于1，稀释菌液直到OD540=1，备用。

1.4.4 抑菌环法测试抗菌性能使用无菌接种环蘸取稀释好的菌悬液在90mmBHI 固体平板培养基上均匀涂抹3 次，每涂抹1 次后将平板培养基转动60°继续涂抹，最后再绕平板培养基的四周涂抹一圈。将一个对照组（F组）的树脂试件置于BHI固体平板培养基中央，将实验组A～E组中各一个试件等距离地放置在以F 组试件为圆心、直径25mm 的同心圆上，盖好培养皿，置于电热恒温培养箱内37℃厌氧条件（80%N2、10%H2、10%CO2）下培养48h 后，观察实验结果。

1.4.5 测量A～F 组菌液OD540值 取 60 只无菌离心管，各加1mL BHI 液体培养基，并接种1.4.3 已备好菌液200μL，随机将离心管分为6组，分别放入消毒好的粘合树脂样本片，37℃厌氧条件（80%N2、10%H2、10%CO2）下培养48h，离心管置于旋涡混合仪上振荡30s，移液器吸取200μL 混匀的菌液滴入96 孔酶标板孔中，用酶标仪检测各孔的OD540值，测量3次，取平均值。

1.4.6 5%氯化镧正畸粘接剂和树脂改良型玻璃离子（RMGIC）抗菌性能的对比实验试件制备：制作直径6mm，厚1mm 的5%氯化镧正畸粘接剂试件20个，RMGIC试件30个，分为1组、2组和3组，每组又包括5%氯化镧组和RMGIC 组试件各10 个（1 组的5%氯化镧组即1.4.5 实验的E 组），1、2、3 组试件在蒸馏水中分别浸泡0h、48h 和1 周。消毒后备用。OD540值测量：测量方法同1.4.5。

1.5 正畸粘接剂粘接性能测试

1.5.1 离体牙准备选取2018-10～2019-02 于内蒙古医科大学附属包头口腔医院颌面外科因正畸治疗拔除的60 颗前磨牙。纳入标准：（1）15～22 岁，平均（18.87±2.07）岁；（2）釉质完整无缺损、色泽正常；（3）病人及监护人知情同意。排除标准：（1）牙体形态颜色异常；（2）有釉质脱矿、龋坏、氟斑牙、四环素牙、釉质发育不全等。60颗离体牙用75%乙醇浸泡30min后，蒸馏水冲洗，用慢速手机沾抛光膏清洁并抛光牙冠表面，将清洁剂冲洗干净，置于生理盐水中备用。

1.5.2 试件制备60 颗离体牙随机分成6 组，每组10 颗，选择金属前磨牙托槽。托槽粘接方法如下：气枪吹干牙面，用35%磷酸酸蚀剂酸蚀冠部颊侧30s，加压冲洗30s，并用气枪吹干牙面呈白垩色。每组离体牙均使用小毛刷将粘接剂预处理剂均匀涂布到酸蚀的釉质表面，光固化10s，根据分组不同，分别将A～F 组相应的粘合树脂均匀涂布到金属托槽的网底，将托槽置于颊面牙冠中央，轻压托槽10s 保持粘接剂厚度均匀一致，用探针小心刮去托槽周围多余的树脂粘接剂，分别从托槽的近中、远中、龈向及向用LED 光固化灯近距离各照射10s。托槽粘接完成的离体牙的根部包埋于高2cm，直径1.5cm 的圆柱形自凝树脂中，冠部完全暴露，自凝树脂固化前调整包埋角度，使托槽的龈边缘平行于地面。将60 个试件浸泡于生理盐水中，置于37℃恒温水浴箱中24h。

1.5.3 剪切强度测试（见图1）实验试件于37℃恒温水浴浸泡24 h 后，固定于万能试验机夹具中，置于检测台上，调节夹具位置使加载力的方向垂直于托槽水平槽沟并平行于牙长轴，刃状加载头以0.5 mm/min 的速度由上到下进行剪切试验，电脑记录力值变化，托槽脱落后停止记录，托槽脱落瞬间的加载力为最大载荷，正畸前磨牙金属托槽网底面积约为9.84mm2，根据最大载荷和托槽底网面积计算剪切强度，计算公式如下[4]：剪切强度（MPa）=最大载荷（N）/托槽底网面积（mm2）。

1.5.4 粘接剂残留指数（ARI）计分10 倍显微镜下观察剪切强度测试后托槽脱落的离体牙釉质表面树脂粘接剂的残留量，记录ARI 计分。本实验采用ARI 四级经典计分法进行计分[5]。0 分：釉质表面无树脂粘接剂残留；1分：釉质表面残留树脂粘接剂的面积小于粘接总面积的50%；2分：釉质表面残留树脂粘接剂的面积大于粘接总面积的50%；3分：釉质表面树脂粘接剂完全残留。

图1 剪切强度实验示意图

1.6 统计学方法

利用SPSS 20.0 软件对所得数据进行统计学处理。菌液OD540值和剪切强度以表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD 检验，按检验水准P＜0.05表示差异具有统计学意义。ARI计分采用χ2检验，多组间比较采用Kruskal Wallis H 多组秩和检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 抑菌环实验结果

经48h 厌氧培养，A-F 组的实验试件均未出现抑菌环（见图2）。

图2 抑菌环实验前后对比图

2.2 菌液OD540值测量结果

A～F 组菌液 OD540值统计结果显示，A～E 组的菌液OD540值均低于F 组，说明实验组粘接剂的抗菌性均强于对照组。随氯化镧比例增加，实验组A～E组的菌液OD540值逐渐下降，E 组的菌液OD540值最小，抗菌性最强。实验组A～E组的OD540值分别与对照组F 组相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）；A组与B 组、B 组与C 组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；其余组两两比较均有统计学差异（P＜0.05）（见表1，图3）。

表1 A～F组菌液OD540平均值比较（）

表1 A～F组菌液OD540平均值比较（）

注：＊表示与A组相比，P＜0.05；#表示与B组，P＜0.05；△表示与C组，P＜0.05；□表示与D组，P＜0.05；◇表示与E组，P＜0.05。

n F P＜0.001images/BZ_94_1409_1241_1537_1302.pngimages/BZ_94_1280_1241_1409_1302.pngimages/BZ_94_1537_1241_1881_1302.pngimages/BZ_94_1409_1362_1537_1423.pngimages/BZ_94_1881_1241_2036_1302.png组别A组C组E组images/BZ_94_1881_1362_2036_1423.png22.040images/BZ_94_1280_1362_1409_1423.pngimages/BZ_94_1537_1362_1881_1423.pngimages/BZ_94_1280_1483_1409_1543.pngimages/BZ_94_1409_1483_1537_1543.png10 10 10images/BZ_94_1537_1483_1881_1543.pngOD值0.72±0.16 0.60±0.09*0.37±0.10*#△images/BZ_94_1881_1483_2036_1543.png

图3 A～F组菌液OD540

1、2、3组菌液OD540值测量，统计结果显示：未经蒸馏水浸泡的RMGIC 组OD540小于5%氯化镧组，差异有统计学意义（P＜0.05），说明RMGIC 48h内的抗菌性强于5%氯化镧的正畸粘合树脂；分别浸泡48h后的RMGIC 组OD540大于5%氯化镧组，差异有统计学意义（P＜0.05），说明浸泡48h 后5%氯化镧正畸粘接剂的抗菌性强于RMGIC；浸泡1周后RMGIC 组OD540和5%氯化镧组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），说明浸泡1 周后的两种粘接剂的抗菌性基本消失。5%氯化镧组和RMGIC 组随着试件浸泡时间增加，菌液OD540均逐渐升高，差异有统计学意义（P＜0.05），说明随着试件浸泡时间增加5%氯化镧的正畸粘合树脂和RMGIC抗菌性均逐渐下降，试件浸泡1周后抗菌性基本消失（见表2，图4）。

表2 1、2、3组菌液OD540平均值比较()

表2 1、2、3组菌液OD540平均值比较()

注：＊表示与1组比较，P＜0.05；#表示与2组比较，P＜0.05。

3组(1周)1.02±0.20*#0.97±0.09*#0.779 0.446 nimages/BZ_95_255_576_482_640.png组别5%氯化镧组images/BZ_95_482_576_570_640.png10images/BZ_95_570_576_782_640.pngimages/BZ_95_782_576_983_640.pngimages/BZ_95_255_703_482_767.pngt images/BZ_95_482_703_570_767.pngimages/BZ_95_570_703_782_767.png1组(0h)0.37±0.10 3.398images/BZ_95_782_703_983_767.png2组(48h)0.62±0.08*2.950

图4 1、2、3组OD540比较

2.3 剪切强度测试结果

对照组F组剪切强度最高，E组最低，随着粘合树脂中氯化镧的比例增加，剪接强度呈现下降趋势，说明A～E组粘接强度逐渐降低。实验组A～E组的剪切强度与对照组F 组比较，其差异均有统计学意义（P＜0.05），说明氯化镧添加后使正畸粘接剂的粘接强度降低；A～E 组任意两组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），说明当氯化镧掺入比例在1%～5%时，其比例变化对剪切强度的影响不显著，即当比例在5%之内可以忽略氯化镧掺入量对剪切强度的影响（见表3，图5）。

表3 A～F组剪切强度平均值比较()

表3 A～F组剪切强度平均值比较()

注：＊表示与F组相比，P＜0.05。

n F P 3.2780.012images/BZ_95_254_2247_383_2308.pngimages/BZ_95_383_2247_489_2308.pngimages/BZ_95_489_2247_856_2308.pngimages/BZ_95_856_2247_1011_2308.pngimages/BZ_95_254_2368_383_2429.pngimages/BZ_95_383_2368_489_2429.pngimages/BZ_95_489_2368_856_2429.pngimages/BZ_95_856_2368_1011_2429.pngimages/BZ_95_254_2489_383_2549.png组别A组C组E组images/BZ_95_383_2489_489_2549.png10 10 10images/BZ_95_489_2489_856_2549.png剪切强度MPa 7.85±1.37*7.68±0.93*7.36±0.53*images/BZ_95_856_2489_1011_2549.png

图5 A～F组剪切强度

2.4 粘接剂残留指数（ARI）计分结果

A～F 组均在牙面看到树脂残留，残留程度不一，以2 分居多（见图6）。ARI 计分统计学分析表明：任意两组间ARI 分值比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）（见表4）。

图6 ARI四级计分图

表4 A～F组ARI 计分比较 (单位：个)

3 讨论

正畸过程中矫治器及附件等的戴入破坏口腔微生态平衡，促进致龋菌的增殖和代谢产酸，釉质中的无机物溶解于酸，釉柱间形成大量微孔，导致釉质折光系数改变，表面质地粗糙，通透性改变呈形态不规则的白垩色斑[6]，即釉质白斑损伤（white spot lesions，WSL）。有学者研究发现佩戴固定矫治器的正畸病人口内的致龋菌水平高于非正畸病人，是造成正畸病人牙釉质脱矿和龋变进程加快的主要原因[7]。有研究表明，和变形链球菌相比，远缘链球菌与龋病的活跃性和光滑面龋的发生更密切[8]。由于远缘链球菌在光滑面龋中的重要致病作用，本研究选用远缘链球菌作为实验菌株，检测氯化镧的抗菌作用。镧元素一方面通过结合并破坏细菌磷脂壁酸结构，改变菌体胞膜的通透性，从而使细菌内外离子交换发生变化，另一方面通过抑制糖酵解过程中菌体内的激酶活性干扰细菌的生长和增殖[9]。在口腔生理条件下，氯化镧可以在脱矿的釉质表面沉积形成含镧的羟基磷灰石，具有使牙体硬组织再矿化的潜力[10]，具有双重抗龋的作用。

抑菌环试验是抑菌剂溶解通过琼脂扩散形成不同浓度梯度，根据抑菌环的大小判断其有无抑菌性。经48h 培养后A～F 组均没有抑菌环，说明氯化镧正畸粘合树脂不是一种溶出性的抑菌物质，不能通过溶解扩散产生抑菌作用，也可能是氯化镧在固体培养基中溶解极少达不到抑菌效果。本实验通过测量A～F 组菌液OD540值可以间接的反应各组粘接剂的抗菌性能，OD540值越大，样本的抗菌性越小。5%氯化镧组的OD540值最小，对远缘链球菌的抗菌性最强；浸泡1周后5%氯化镧正畸粘合树脂的抗菌性消失，可能是因为此粘接剂是将氯化镧粉末直接与正畸粘合树脂混合而成，树脂固化后只有表面的氯化镧可以起到抗菌作用，固化树脂内部大量的氯化镧不能释放产生抗菌性。

本实验将不同比例的氯化镧添加到牙釉质粘合树脂中，通过剪切强度测试分析氯化镧掺入比例对牙釉质粘合树脂粘接强度的影响。有研究报道正畸粘接剂在粘接托槽24h后的剪切强度远高于粘接固化后的即刻剪切强度[11]。所以本实验在离体牙托槽粘结后于37 ℃恒温生理盐水中浸泡24h 后再测试剪切强度。实验结果显示对照组剪切强度的平均值高于实验组，说明氯化镧的添加使得牙釉质粘合树脂的粘接强度下降。刘秀菊等[12]经实验研究发现，将0.5%氧化镧和1%纳米二氧化硅添加到氧化锆陶瓷中，可以在一定程度上有效提升陶瓷的机械强度。臧旖欣经研究发现添加了2%～3%氯化镧的树脂基托对白色念珠菌有较强抗菌性，且不影响树脂基托的机械性能[13]。正畸粘接剂中添加氯化镧后，粘接强度却下降，可能是因为本实验是在正畸牙釉质粘接剂中直接添加氯化镧，通过此类方法所得的粘接剂粘接完成后会有过多的游离单体残留在粘接界面，破坏粘接树脂的网状结构和与酸蚀釉质间的微机械锁结，从而导致粘接强度降低[14]。如果将无机物氯化镧和季铵抗菌单体结合后共同添加到树脂基质中，共价聚合后不仅可以增加粘接剂抗菌的持久性，还不会降低粘接剂的机械强度[15]。氯化镧的掺入虽然会降低正畸粘接剂的粘接强度，但各实验组剪切强度均大于7.0MPa，仍可满足正畸临床固定矫治所需的剪切强度7～9MPa[1]，因而可以考虑将氯化镧作为抗菌活性物质应用到牙釉质粘合树脂中。

ARI评分是用来评估剪切实验后牙釉质粘合树脂的断裂方式，ARI 评分能够量化釉质表面上残留的粘接剂。ARI计分低表示托槽脱落后釉质表面残留的粘接剂少，粘接剂的断裂位置在粘接剂—牙釉质界面，利于托槽脱落后的二次粘接或矫治完成后釉质表面残留粘接剂的清理，反之亦然。所以在剪切强度足够的情况下低ARI 计分的粘接剂临床使用更方便。本实验ARI 评分结果显示六组粘接剂的粘接剂残留指数无明显区别，即1%～5%的氯化镧不会影响托槽脱落后牙面的ARI 计分，因此该材料断裂时不会增加损伤牙釉质的风险。

综上所述，添加5%氯化镧的正畸粘接剂对致龋菌的抑制作用较强，可满足正畸临床固定矫治所需的粘接强度，且脱粘接后不会增加损伤牙釉质的风险，因此，本实验为氯化镧新型粘接剂用于托槽的粘接提供可能性。